微囊藻毒素LR暴露促进人肝细胞HL7702增殖

【作者】 刘景辉； 黄朴； 徐立红；

【机构】 浙江大学医学院生物化学系；

【摘要】 【研究背景】微囊藻毒素是一种单环七肽类化合物,由蓝藻的一些种属产生,在发生水华时被大量排到水体中,进而通过食物链进入人或动物的体内,威胁人类的健康。在已经发现的微囊藻毒素中微囊藻毒素LR(MC-LR)是最常见和毒性最大的一种,肝脏是其最主要的靶器官。研究表明MC-LR不仅可以诱导肿瘤的发生,而且在肿瘤发展和转移中也有促进作用。但是,其具体机制尚不明确。一般认为,MC-LR的致毒机理主要是其对蛋白磷酸酶2A(PP2A)和蛋白磷酸酶1(PP1)的特异性抑制,进而造成其下游信号通路紊乱而产生一系列细胞效应。本研究选取人肝细胞系HL7702为研究对象,通过研究MC-LR进入细胞后对PP2A全酶和其相关通路蛋白的影响及引发的细胞效应,探讨MC-LR可能的促癌机理。【方法】HL7702细胞暴露于不同浓度的MC-LR(0,1μM,5μM,10μM)1-72小时后,高通量实时细胞分析系统(RTCA SP)和MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞周期;细胞核染色法检测细胞凋亡:免疫印迹法检测MC-LR在细胞内的积累及其与PP2A/C的结合情况,同时结合细胞免疫荧光法检测相关蛋白表达水平及细胞定位;免疫共沉淀法检测蛋白之间的相互作用。【结果】一,MC-LR处理HL7702细胞36小时后,开始促进细胞增殖,72小时后细胞有明显增殖现象;但细胞周期和细胞凋亡没有明显改变。二,MC-LR处理HL7702细胞1小时后,可在细胞内形成显著的累积并结合到PP2A/C亚基上,且不随时间延长而增加。三,MC-LR抑制PP2A全酶活性,且24小时后酶活性不再下降;同时,PP2A非特异性调节亚基α4与PP2A/C结合减少,释放储存的PP2A/C。四,MC-LR通过上调Akt(Thr308和Ser473)、S6K1(Thr389)、S6(Ser235/236)和4E-BP1(Thr37/46)磷酸化水平激活Akt/mTORC1/S6K1信号通路。四,MC-LR使转录因子c-Myc(Ser62)、c-Jun(Ser63)和凋亡相关蛋白Bcl-2(Ser70)、Bad(Ser136)的磷酸化水平升高。五,MC-LR通过上调Plk1磷酸化水平和减弱Cdc25C与14-3-3结合激活Cdk1。【结论】MC-LR暴露36h以上促进了人肝细胞HL7702的增殖,其主要机制是对Akt/mTORC1/S6K1的激活。另外,磷酸化的Bcl-2、Bad、c-Myc和c-Jun水平的上调可能参与了这一过程。PP2A全酶活性的抑制是上述分子改变的主要原因。更多还原