α-芋螺毒素TxIB的重组表达及其功能研究

【作者】 于津鹏； 朱晓鹏； 雷宇苗； 长孙东亭； 罗素兰；

【机构】 海南大学热带生物资源教育部重点实验室海口市海洋药物重点实验室； 海南大学农学院；

【摘要】 烟碱型乙酰胆碱受体（Neuronal nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs）是一类广泛分布于中枢及外周神经系统的配体门控离子通道受体。α6β2^*nAChRs是其中重要的一种亚型,其作用与尼古丁成瘾、运动功能性障碍相关,是研究和治疗相关疾病的重要靶点。α-芋螺毒素（Conotoxin,CTx）TxIB是从海南产织锦芋螺（Conus textile）中发现的,能特异作用于α6β2^*nAChRs,其半阻断剂量(IC₅₀)为28 nM。TxIB除了阻断α6β2^*亚型外,对其他已知的nAChRs亚型几乎都没有阻断活性,是迄今对α6β2^*9nAChRs选择性最好的阻断剂,可用于区分α6β2^*与其他nAChRs亚型,并可作为研究α6β2^*nAChRs结构和功能的重要探针。目前获得芋螺毒素多肽通常采用化学合成的方法,但由于合成成本高、产率低,限制了其大规模研究应用。本研究利用生物合成的方法,将TxIB的基因片段连接到大肠杆菌表达载体pET-31b（+）上,获得的重组载体转入大肠杆菌BLR（DE3）pLysS进行表达,利用镍离子金属鳌合亲和层析技术对目的产物进行分离纯化,用生物法成功合成重组蛋白KSI-TxIB-His₆。利用溴化氰（Cyanogen bromide,CNBr）切割技术,去除了融合蛋白中的酮类固醇异构酶（Ketosteroidisomerase,KSI）和His-tag组氨酸标签,并通过高效液相色谱技术（HPLC）分离纯化了重组芋螺毒素TxIB（rTxIB）。利用双电极电压钳技术,对rTxIB的活性进行鉴定,结果表明,rTxIB能专一性作用于α6β2^*nAChRs,IC₅₀为89 nM,与天然TxIB的活性接近。该研究成功利用大肠杆菌表达了α-芋螺毒素TxIB,并对rTxIB的活性进行了检测,该研究结果可为其他芋螺毒素的生物法合成提供方法借鉴。更多还原