新型聚多肽与FGF21融合表达显著提高半衰期并改善生物学功能

【作者】 尹骏； 包立晨； 田浤； 高向东； 姚文兵；

【机构】 中国药科大学生命科学与技术学院；

【摘要】 聚多肽融合技术是近年来开发的长效化技术,通过设计的特异性氨基酸链可采用重组DNA技术与蛋白质药物融合表达,明显延长蛋白质药物血浆半衰期的原理与PEG修饰相同,都是显著增大药用蛋白的流体动力学体积。我们将一种新型的完全模拟PEG修饰的不带电荷的、亲水的、柔性的聚多肽与人成纤维细胞生长因子21(FGF21)融合表达,进行理化性质,免疫原性、药代动力学和生物学活性研究。将筛选得到的各种长度的新型聚多肽与FGF21在大肠杆菌中融合表达,对融合蛋白的理化性质,用Western blotting、圆二色谱、MALDI-TOF、等电点、生物可降解性等方法进行检测,以证实融合蛋白是否与理论设计相符;然后检测聚多肽的免疫原性和用ELISA的方法测定各融合蛋白在小鼠中的血浆半衰期;最后通过饮食诱导的肥胖小鼠(DIO)模型进行体内活性研究。我们筛选得到满足要求的各种长度的聚多肽链,与FGF21融合后在大肠杆菌中都为可溶表达,通过镍亲和层析柱和强阴离子交换柱两步纯化得到各融合蛋白;圆二色谱检测随着聚多肽链长度的增加,198nm处的负值显著增加,表明无规卷曲的含量也逐渐显著增加;聚多肽融合FGF21的等电点与原型FGF21无变化,pI都约在5.4,可以说明聚多肽本身不带电荷的性质,与蛋白融合并不会改变其等电点;融合蛋白在小鼠血浆中48小时后才开始显示出有降解的迹象,说明融合蛋白对血清蛋白酶引起的降解有抗性,这是聚多肽能显著增强药代动力学性质的一个因素,而在肾均浆中快速降解说明了聚多肽分子显著区别于PEG分子的特性,可以克服PEG分子在肾细胞中不易被降解从而易引起肾空泡现象的问题;融合蛋白在小鼠体内的免疫原性也明显下降,不加佐剂组并没有检测到相应抗体,表明聚多肽分子在小鼠体内可以显著降低免疫原性;原型人FGF21在小鼠中的血浆半衰期只有0.34h,对于融合了聚多肽的蛋白,当聚多肽长度达到200个氨基酸时,半衰期达到5.67h,聚多肽长度从200到400个残基增加了200个残基使半衰期增加到8.8h。并且聚多肽长度增加到600使半衰期延长到12.93h,这些结果显示聚多肽长度具有惊人的阈值,它导致体内半衰期高于比例的延长。原型FGF21和聚多肽融合的FGF21对于高脂饮食诱导的肥胖小鼠都有显著的减肥和降糖效果。在该模型小鼠中,持续15天给药后,聚多肽融合的FGF21的降低体重效果以剂量依赖的方式增强,与FGF21原型等摩尔质量的聚多肽融合的FGF21的中剂量组的降低效果已经显著优于原型FGF21。并且在HFD小鼠进行口服糖耐量实验(OGTT),聚多肽融合的FGF21的降低血糖效果也呈以剂量依赖的方式增加。综合来说,PsTag融合的FGF21很好的保留了全部的生物活性,并且因为其能显著延长半衰期的原因,在体内的疗效会显著优于未融合的FGF21。本实验成功构建了人工设计的由Ala、G1y、Pro、Ser、Thr这五种氨基酸组成的无结构的、不带电荷、无免疫原性的聚多肽分子,与FGF21融合表达,显著改善其理化性质及体内活性并解决半衰期短等问题。更多还原