壳聚糖-SOD的制备及其性质研究

【作者】 许玲华； 刘纯慧；

【机构】 山东大学药学院与国家糖工程技术研究中心；

【摘要】 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是生物体内唯一的超氧阴离子高效清除剂,不但维持生物体内超氧阴离子的产生与消除的动态平衡,而且能有效抑制自由基过多引发的各种氧化损伤,因此治疗或预防心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病以及癌症等疾病方面具有重要的应用前景和潜力。然而,天然SOD与其他蛋白质类生物大分子类似,存在稳定性差、体内半衰期短(约5~10 min)、与细胞的亲和力差以及免疫原性等不足,限制了它的的应用研究和开发。其中,利用聚合物进行化学结构修饰被认为是提升蛋白质性能的有效手段。因此,本研究在前期研究基础上,将2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)成功接枝到壳聚糖的C6-OH上得到水溶性显著提高的O-(羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖(O-HTCC)衍生物,采用茚三酮法测得O-HTCC的自由氨基含量约为70%。然后通过碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)活化法将O-HTCC连接到SOD的羧基上,按O-HTCC:SOD=1:1(w/w)进行修饰反应,SOD的修饰率高达90%以上,采用DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子交换柱层析分离纯化得到结合物O-HTCC-SOD。SDS-PAGE和HPLC分析表明,O-HTCC的引入使得到的结合物的重均分子量较SOD显著增大,并表现为连续分布的均一组分。邻苯三酚法测定结合物的酶比活为天然SOD的81.1%,表明季铵化壳聚糖修饰对SOD的活性影响较小。圆二色谱分析表明O-HTCC的修饰对SOD表现酶活的优势构象β构象(β-折叠和β转角)影响较小,这与酶比活测定结果相一致;另一方面,SOD被O-HTCC修饰后,α-螺旋显著增加,无规则卷曲明显减少,提示O-HTCC-SOD结合物的氨基酸在空间上的排布更加有序。总之,O-HTCC修饰SOD的效率较高,且修饰酶的活性保持率较高,是一种具有防治超氧阴离子相关疾病的新颖先导化合物。更多还原