桑椹提取物减缓Aβ25-35致PC12细胞损伤的机制研究

【作者】 庞伟； 宋楠； 蒋与刚； 杨红澎； 谭龙； 李海强；

【机构】 军事医学科学院卫生学环境医学研究所；

【摘要】 目的建立Aβ25-35致PC12细胞损伤模型基础上,观察桑椹提取物(ME)的保护作用并确定其有效剂量;应用基因芯片技术筛选ME干预Aβ25-35致PC12细胞损伤的差异表达基因并加以验证,阐明ME神经保护作用的分子机制。方法 1培养PC12细胞,用不同浓度的Aβ25-35处理细胞24h,采用MTT法确定Aβ25-35的损伤浓度。2用不同浓度的ME预孵育细胞24h,再给予20μmol/L Aβ25-35继续损伤24h,采用MTT法筛选ME的干预剂量。3DCFH-DA、Hoechst33342染色法分别检测细胞内ROS含量、细胞凋亡。4基因芯片技术检测全基因组范围基因mR NA表达水平的变化,筛选出ME作用的差异表达基因,并对基因群特异性的变化特征和规律进行描述。5采用RT-PCR和Western blot技术验证芯片结果筛选出的目的基因。结果 1Aβ25-35浓度达20μmol/L时,细胞存活率为(49.79±14.16)%,接近半抑制率值,可作为损伤浓度。2ME对Aβ25-35致PC12细胞损伤具有保护作用,其有效浓度为100μg/ml、200μg/ml。3与对照组相比,Aβ25-35组细胞内ROS的生成显著升高、细胞凋亡率明显增加(P<0.05);与Aβ25-35组相比,200μg/ml ME预孵育组细胞内ROS的生成显著减少、细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。4基因芯片共分析了24,358个基因。结果显示,与对照组比较,20μmol/L的Aβ25-35组中5个基因上调,16个基因下调;与Aβ25-35组相比,200μg/ml ME干预组中55个基因上调,98个基因下调;经聚类分析,聚簇的基因共144个;根据Gene Ontology(GO)功能分析,所筛选出的差异基因主要涉及细胞粘附、肽酶活性、细胞因子活性、离子结合活性及调节血管生成等功能;结合NCBI相关数据库发现:在筛选出的差异基因中基因Apaf1、Bace2和Plcb4不但在"Alzheimer’s disease pathway"中富集,而且ME干预后其基因表达水平均明显下调。5RT-PCR结果显示,20μmol/L Aβ25-35处理PC12细胞24后,Apaf1、Bace2及Plcb4的mR NA表达明显增加(P<0.05);200μg/ml ME预孵育能显著抑制Aβ25-35诱导的Apaf1、Bace2、Plcb4 m RNA表达的上调,(P<0.05)。与对照组比较,Aβ25-35组BACE2蛋白表达明显上调(P<0.05);ME预孵育后不能有效抑制Aβ25-35诱导的BACE2蛋白表达的上调(P>0.05)。结论适宜剂量的ME对Aβ25-35致PC12细胞损伤有明显的保护作用,其机制与抗氧化、抑制凋亡以及调控Apaf1、Bace2和Plcb4等AD相关基因表达有关。更多还原