刺萼龙葵种子中SrMAN基因的克隆和表达特性研究

【作者】 王旭； 王新果； 陈金奕； 陈景超； 黄兆峰； 杨龙； 张朝贤； 魏守辉；

【机构】 中国农业科学院植物保护研究所；

【摘要】 刺萼龙葵(Solanum rostratum Dunal)是原产北美的有毒有害入侵杂草,具有适应性广、竞争力强、繁殖量大、传播快速的特点,于1981年首次在辽宁省朝阳市发现,目前已经扩散至中国东北、西北、华北部分地区,并且有逐步向西、向南扩展的趋势。种子是刺萼龙葵传播扩散的根源,休眠与萌发是其种子生活史的重要阶段。种子完成萌发过程的关键是突破胚乳帽的限制,甘露聚糖酶是降解胚乳帽主要成分半乳甘露聚糖主链的关键酶,控制该酶合成的基因为甘露聚糖酶基因(MAN)。本研究通过PCR技术分离克隆刺萼龙葵甘露聚糖酶基因SrMAN1和SrMAN2,同时采用实时荧光定量技术测定两基因在种子不同萌发时期及不同激素处理下的表达量变化,并将该基因在大肠杆菌中进行克隆和表达,以明确刺萼龙葵SrMAN基因的序列特征和表达特性,为其种子休眠萌发机制的阐明提供依据。根据刺萼龙葵近缘种的甘露聚糖酶基因的保守区序列设计引物,分段克隆、拼接并全长扩增得到两种甘露聚糖酶基因序列。其中SrMAN1基因全长1921bp,与番茄LeMAN1基因序列相似性87%;SrMAN2基因全长3075bp,与番茄LeMAN2基因序列相似性为88%。在线工具预测表明,SrMAN1基因的ORF包含1143bp,编码380个氨基酸,前40个氨基酸为信号肽,后面340个氨基酸为甘露聚糖酶成熟肽,蛋白分子量为42.9KD,等电点为5.4。SrMAN2基因的ORF包含1242bp,编码413个氨基酸,前26个氨基酸为信号肽,后面387个氨基酸为甘露聚糖酶成熟肽,蛋白分子量为46.6KD,等电点为5.2。氨基酸序列分析表明SrMAN1与SrMAN2同属于糖苷水解酶家族5。Q-PCR结果表明,赤霉素和清水处理下,SrMAN1与SrMAN2基因均在第三时期(胚芽延长至2mm、胚根延长至1cm)达到表达高峰,且两种处理下,该基因在同一时期的表达量没有显著差异。在表达高峰时,SrMAN1基因的表达量是SrMAN2基因表达量的6-7倍。随着浸种时间的延长,在脱落酸的处理下,两个基因的表达量没有显著变化,都维持在较低的水平;而在赤霉素与清水的处理下,两个基因的表达量都是先升高再降低,并且赤霉素使两个基因的表达高峰提前出现;赤霉素处理下,SrMAN1基因的表达高峰高于水处理下的表达高峰,SrMAN2基因的表达高峰低于水处理下的表达高峰。将SrMAN1和SrMAN2基因在大肠杆菌中进行克隆与表达,成功构建重组表达质粒pET-32a-SrMAN1与pET-32a-SrMAN2,实现了在BL21(DE3)中的诱导表达。SDS-PAGE表明,SrMAN1和SrMAN2基因表达的蛋白的分子量分别约为43和46 KD,与预测的分子大小一致。将表达菌体的提取物进行凝胶扩散试验,甘露聚糖酶底物显示出不同程度的水解圈,证实了表达的蛋白具有甘露聚糖酶水解活力。更多还原