抗性稗草乙烯生物合成途径中关键基因的克隆与表达分析

【作者】 杨霞； 董明超； 李永丰； 张自常； 谷涛； 邵佳慧；

【机构】 江苏省农业科学院植物保护研究所；

【摘要】 【背景】稗草(Echinochloa crus-galli)是全球农业生产中的重要恶性杂草之一,同时也是我国稻田主要恶性杂草之首,严重影响水稻的生长发育和产量。除草剂作为一种重要的化学防控手段,随着长期单一频繁使用引起选择压的产生,导致我国稻田稗草已对二氯喹啉酸等几大类除草剂产生了抗药性。为明确稗草对二氯喹啉酸的抗性机制,通过对乙烯生物合成途径中的关键基因1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)基因的克隆与表达分析,来探究其与稗草对二氯喹啉酸抗性之间的关系,为解析稗草抗药性研究奠定基础。【方法】根据稗草转录组测序得到的ACS基因和ACO基因序列为探针设计引物,利用PCR方法分别从抗二氯喹啉酸的稗草(R)和敏感性稗草(S)的cDNA中扩增出EcACS基因和EcACO基因的全长序列。分别将EcACS基因和EcACO基因序列连接至pMD-18T载体后,对EcACS和EcACO序列进行测序,并对其氨基酸序列进行差异性比较。以β-actin基因为内参,荧光定量PCR分析抗性和敏感性稗草间的EcACS和EcACO的基因表达水平差异。分别将抗性和敏感性稗草的EcACS和EcACO连接至原核表达载体pMAL-c5x,并转化至大肠杆菌BL21,经终浓度为0.4 mmol/L IPTG于18℃诱导16 h后,检测EcACS和EcACO蛋白的表达情况。最后以MBP吸附柱分离纯化后的MBP::EcACO为对象,ACC为底物,抗坏血酸和氧为辅助底物,Fe2+和CO2为辅助因子,用气相色谱仪分析单位时间内乙烯的生成量,比较抗性和敏感性稗草EcACO蛋白的活性差异。【结果】从稗草中克隆得到EcACS基因和EcACO基因,序列分析结果表明:EcACS-R基因全长为1630bp,其中编码区序列1455bp,编码484个氨基酸,预测蛋白质相对分子量和理论等电点分别为53kD和6.25;EcACO-R基因全长为1000bp,其中编码区序列为936bp,编码311个氨基酸,预测蛋白质相对分子量和理论等电点分别为35kD和5.4。氨基酸序列差异比较结果显示:抗性稗草中EcACS-R氨基酸序列存在4个突变位点,即V230→G、D259→A、A307→V和K442→R,R442之后缺失4个氨基酸;抗性稗草中EcACO-R氨基酸序列存在5个突变位点,即F98→Y、G101→D、Q206→R、G270→V和A272→G,其中有3个突变位点位于蛋白预测结构域DIOX N和2OG-FeII_Oxy中。成功构建了MBP::EcACS和MBP::EcACO的表达载体,经IPTG诱导后,两种表达载体均获得了表达,表达条带大小和理论值相同,但MBP::EcACS在大肠杆菌中不可溶。经荧光定量PCR分析显示,EcACO-R和EcACO-S的基因表达水平无显著性差异,但气相色谱仪分析结果表明敏感EcACO基因表达纯化产物单位时间内乙烯释放量是抗性EcACO基因的2.15倍。【结论】从抗二氯喹啉酸的稗草中首次克隆得到了EcACS基因和EcACO基因。较敏感性稗草相比,抗性稗草中EcACS基因的氨基酸序列存在4个突变位点,EcACO基因的氨基酸序列存在5个突变位点。这些突变位点可能引起乙烯释放速率降低,导致稗草对二氯喹啉酸产生抗药性。更多还原