抗卵巢癌单链抗体6B11ScFv与小鼠IL-12融合蛋白的构建、表达与功能研究

【作者】 程洪艳； 昌晓红； 叶雪； 马瑞琼； 崔恒；

【机构】 北京大学人民医院妇科肿瘤中心；

【摘要】 背景:6B11是我实验室已经制备的卵巢癌抗独特型单抗,研究表明该抗体能够模拟卵巢癌抗原CA166-9,诱导机体产生特异性抗卵巢癌细胞免疫和体液免疫。目的:本研究采用基因工程技术将6B11单链可变区基因与鼠IL-12(mI L-12)融合,构建真核表达载体6B11ScF v-mI L-12,进行融合蛋白真核表达并研究其免疫学及生物学功能,为临床应用提供实验依据。方法:采用PCR方法构建融合基因IL-12(p40-p35)-6B11Sc Fv(VH-VL),插入真核表达载体p SecT aq2B和p SBI,成功构建了真核表达载体p Sec Tag2B/6B11Sc Fv-mI L-12和p SBI/6B11Sc Fv-mI L-12。转染CHO和293EBNA细胞,筛选阳性克隆,扩大培养,建立了融合蛋白稳定和瞬时表达细胞株,诱导蛋白表达。ELISA和Western Blot对融合蛋白的体外免疫活性进行了检测;混合淋巴细胞增殖实验,淋巴细胞表型分析,肿瘤细胞杀伤实验检测融合蛋白体外生物学活性;C57BL/6J小鼠卵巢癌皮下荷瘤模型体内免疫,观察6B11Sc Fv—mI L-12融合蛋白体内抗卵巢癌的功能。结果:体外免疫活性实验表明,6B11Sc Fv-mI L-12融合蛋白具有6B11Sc Fv和mI L-12的双重免疫学活性,能够特异性结合卵巢癌单克隆抗体COC166-9及抗小鼠IL-12抗体。体外生物学活性实验表明,6B11Sc Fv-mI L-12融合蛋白能够刺激植物血凝素(Phytohemagglutinin,PHA)活化的淋巴细胞增殖;增加NK细胞比例,诱导LAK和CIK活化;诱导IFN-γ生成增加;6B11Sc Fv-mI L-12融合蛋白活化的淋巴细胞对CA166-9阳性的肿瘤细胞具有特异的杀伤作用。体内功能研究表明,6B11Sc Fv-mI L-12融合蛋白能够在一定程度上抑制C57BL/6J小鼠卵巢癌ID8皮下瘤的生长。结论:6B11ScF v-mI L-12融合蛋白具有6B11Sc Fv和mI L-12的双重免疫和生物学活性,有可能作为疫苗用于卵巢癌的免疫治疗。本研究为6B11Sc Fv-mI L-12融合蛋白的进一步深入研究和应用奠定了基础。更多还原

【Abstract】 景:6B11 是我实验室已经制备的卵巢癌抗独特型单抗,研究表明该抗体能够模拟卵巢癌抗原 CA166-9,功大学人民医院妇科肿瘤中心,北京 1000背诱导机体产生特异性抗卵巢癌细胞免疫和体液免疫。目的:本研究采用基因工程技术将 6B11 单链可变区基因与鼠 IL-12(mIL-12)融合,构建真核表达载体 6B11ScFv-mIL-12,进行融合蛋白真核表达并研究其免疫学 及 生 物 学 功 能 , 为 临 床 应 用 提 供 实 验 依 据 。 方 法 : 采 用 PCR 方 法 构 建 融 合 基 因IL-12(p40-p35)-6B11ScFv(VH-VL),插入真核表达载体 pSecTaq2B 和 pSBI,成 构建了真核表达载体pSecTag2B/6B11ScFv-mIL-12 和 pSBI/6B11ScFv-mIL-12。转染 CHO 和 293EBNA 细胞,筛选阳性克隆,扩大培养,建立了融合蛋白稳定和瞬时表达细胞株,诱导蛋白表达。ELISA 和 Western Blot 对融合蛋白的体外免疫活性进行了检测;混合淋巴细胞增殖实验,淋巴细胞表型分析,肿瘤细胞杀伤实验检测融合蛋白体外生物学活性;C57BL/6J 小鼠卵巢癌皮下荷瘤模型体内免疫,观察 6B11ScFv— mIL-12 融合蛋白体内抗卵巢癌的功能。结果:体外免疫活性实验表明,6B11ScFv-mIL-12 融合蛋白具有 6B11ScFv 和 mIL-12 的双重免疫学活性,能够特异性结合卵巢癌单克隆抗体 COC166-9 及抗小鼠 IL-12 抗体。体外生物学活性实验表明,6B11ScFv-mIL-12 融合蛋白能够刺激植物血凝素(Phytohemagglutinin,PHA)活化的淋巴细胞增殖;增加 NK 细胞比例,诱导 LAK 和 CIK 活化;诱导 IFN-γ生成增加; 6B11ScFv- mIL-12 融合蛋白活化的淋巴更多还原