肿瘤低氧微环境特异性诱导巨噬细胞M2型极化的机制研究

【作者】 张俊； 董蓉； 林冠宇； 丁玲； 何俏军； 杨波；

【机构】 浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所；

【摘要】 目的:长期以来,肿瘤低氧研究的重心是其对肿瘤细胞本身的影响,而忽视了低氧通过作用于非肿瘤细胞来推动肿瘤发生发展的可能性。肿瘤相关巨噬细胞,作为非肿瘤细胞的主要成分,被认为是肿瘤恶性行为的参与者。因此,系统研究低氧对巨噬细胞表型极化的影响和相关作用机制,并探讨该作用模式与低氧介导的肿瘤恶性行为的相关性,有助于从新的角度完善肿瘤低氧研究领域,推动相关治疗理念的革新。方法:(1)流式细胞术检测巨噬细胞膜表面抗原表达;(2)免疫组化及免疫荧光检测组织切片相关蛋白表达;(3)PCR检测M2型巨噬细胞相关mRNA水平;(4)划痕修复和Transwell小室法检测细胞运动和迁移能力;(5)管腔形成实验检测HUVEC细胞的管腔生成能力;(6)C57动物模型检测LLC的肺转移率;(7)表达谱芯片分析相关差异基因的表达;(8)Western blot考察相关信号通路蛋白的表达。结果:55例临床NSCLC病人样本的免疫组化结果表明M2型巨噬细胞与肿瘤转移密切相关。LLC瘤组织切片的结果显示肿瘤中的巨噬细胞(F4/80+)大多为M2型(CD209~+)且主要集中在低氧区域(PIMO~+)。低氧处理C57BL/6小鼠可显著促进LLC的肺转移,且免疫荧光结果显示F4/80~+区域的CD209表达强于常氧对照组。流式细胞术结果显示低氧下可促进极化因子(LLC-CM、IL6、IL4和IL13)诱导RAW264.7细胞和BMDM原代巨噬细胞表达CD209。RT-PCR结果显示低氧下IL6诱导的巨噬细胞的M2型基因Arg1和Ym1的mRNA水平的显著增加。基因芯片结果显示低氧下IL6诱导的巨噬细胞表达低水平的M1型基因和高水平的M2型基因。低氧和IL6刺激后的RAW264.7不仅可在体外显著促进HUVEC的管腔形成和LLC细胞的迁移运动,还可在体内显著增加LLC的肺转移和血管生成。在机制研究方面,通过特异性抑制剂与分子生物学手段的应用,发现IL6/STAT3信号通路及低氧相关的HIF信号通路并不直接参与低氧介导的巨噬细胞M2型极化。进一步采用基因芯片分析低氧下的差异基因,发现MAPK信号级联变化明显。虽然westernblot结果显示低氧能显著增加巨噬细胞中pERK、pp38、p-JNK的表达,但只有抑制ERK信号后才能逆转低氧介导的巨噬细胞M2型极化及相关功能。结论:低氧微环境通过激活ERK信号促进巨噬细胞向M2型极化,其效应为在体内外均能显著促进肿瘤的转移和血管生成。上述研究结果阐述了低氧在巨噬细胞极化中的重要作用,从新的角度探讨了低氧微环境对肿瘤发生发展的影响,为进一步革新当前肿瘤治疗策略,提高肿瘤治愈率提供了理论基础。更多还原