CFL2低表达对C2C12细胞肌球蛋白重链基因的影响研究

【作者】 朱弘焱； 苏玉虹；

【机构】 辽宁医学院畜牧兽医学院畜产品质量与安全工程重点实验室；

【摘要】 目的分析CFL2基因低表达后对C2C12细胞肌球蛋白重链基因(MyHC)的影响,及相关信号通路因子的表达变化。材料方法(1)实验材料:小鼠成肌细胞C2C12细胞株、siRNA、pEGFP-N1-CFL2重组质粒、TaqMan探针、转染试剂、TRITC标记的毒伞素。(2)实验方法:①将两对siRNA的序列转染至正常的及2%马血清诱导分化C2C12细胞中,总RNA提取、反转录后利用半定量及蛋白质印迹法筛选CFL2特异性siRNA的序列。②将选定的高效siRNA序列按适宜的作用浓度转染C2C12细胞,将保存的pEGFP-N1-CFL2重组质粒转染C2C12,实验分为高表达,低表达及正常组。利用荧光染色的方法观测C2C12细胞中各表达对CFL2和F-actin的影响。③利用实时定量PCR分析低表达与正常组中肌球蛋白重链基因(MyHCslow、MyHC2x、MyHC2b)的表达水平。利用Western Blot检测未分化C2C12中相关通路因子(P38、ERK2、CBP基因)的表达,实时定量PCR分析AMPKα1、MuRF1、MEF-2的表达。结果与正常组相比,低表达组中CFL2在胞浆中明显减少。经毒伞素对细胞骨架染色发现,F-actin的束状结构有密集趋势,CFL2高表达细胞中有明显的rod结构。在C2C12细胞分化前导入CFL2基因siRNA能显著下调CFL2基因表达,并使3种MyHC基因表达显著下降;而细胞分化后导入,对四种基因表达均无影响。siRNA干扰CFL2基因表达后,信号通路因子P38、CBP、AMPKα1和MEF-2表达均下调;其余二者基因表达上调。讨论CFL2基因低表达能够影响细胞骨架,明显下调细胞分化前的MyHC表达,说明CFL2影响MyHC的形成;其影响原因是通过信号通路因子的表达变化。更多还原