小麦酵母双杂交cDNA文库的构建及与小麦黄花叶病毒CP互作蛋白的初筛

【作者】 戚文平； 孙炳剑； 陈剑平； 李洪连；

【机构】 河南农业大学植物保护学院； 浙江省农业科学院；

【摘要】 小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus)是一种重要的小麦病毒,为了研究小麦黄花叶病毒与小麦蛋白互作的机制,采用酵母双杂交技术进行研究。首先从小麦品种中国春的幼苗根叶中提取总RNA,分离mRNA,利用GATE-WAY技术将小麦cDNA片段定向转移到目的载体,通过重组反应进行载体构建,获得小麦酵母双杂交cDNA文库。并根据WYMV外壳蛋白(CP)序列设计特异引物,从感病小麦植株的总RNA中克隆外壳蛋白基因,构建pGBKT7-CP转化Y2HGOLD,Mating法筛选和WYMV外壳蛋白互作的片段,并进行质粒共转化验证。经检测,构建的小麦酵母双杂交cDNA文库的滴度为8.24×10~5CFU/ml,库容量为5.77×10~6CFU,重组率为100%,成功构建可以用于酵母双杂交的cDNA文库。试验表明诱饵载体表达产物对酵母无毒性作用,通过酵母双杂技术获得了于WYMV外壳蛋白互作的阳性克隆,质粒共转化初步试验验证了WYMV外壳蛋白和PEPCK、IPAL蛋白的互作关系。本实验构建cDNA文库的成功构建为后期互作蛋白的筛选奠定了基础,为明确WYMV的致病机制提供更多的依据,以期从分子水平上进一步阐明WYMV的致病机制.更多还原