苹果炭疽叶枯病菌致病缺陷型突变体的筛选及致病相关基因的克隆

【作者】 张俊祥； 冀志蕊； 迟福梅； 周宗山；

【机构】 中国农业科学院果树研究所；

【摘要】 近几年,苹果一种重要的新病害——苹果炭疽叶枯病,在我国山东、河北、陕西、辽宁和山西等苹果主产区大发生,给苹果产业带来巨额损失。苹果炭疽叶枯病菌（Glomerella cingulata;无性,Colletotrichum spp.）既为害苹果叶片,又为害果实。被侵染的叶片从侵染到发病落叶,仅需3⁴天,且侵染率极高,常造成树体早期大量落叶,严重削弱树势,影响果实产量和品质;被侵染的果实,在近成熟时开始发病,造成采收前大量落果。为了较好地控制一种植物病害,明确病原菌的致病机理是必要的基础性工作。前期,本实验室建立和优化了农杆菌介导的苹果炭疽叶枯病菌遗传转化技术体系,构建了苹果炭疽叶枯病菌菌株W16的T-DNA插入突变体库,为该病菌的致病机理研究奠定了基础。以感病品种嘎拉为寄主,采用无伤接种方法,从T-DNA插入体库中筛选到一些致病性变异的突变体。突变体M421、M755和M903致病力明显下降,突变体M285和M744丧失了致病能力,突变体M598和M856丧失了产孢能力和致病能力。Southern杂交结果显示,上述突变体的T-DNA插入均为单拷贝插入,并对其中的突变体M285进行了初步研究。利用TAIL-PCR获知侧翼序列,结合围小从壳菌菌株23基因组数据库,得知突变体M285被插入突变的基因位于基因组数据库scaffold₁序列。Fgenesh程序预测该基因是单一外显子;预测转录起始位点（TSS）位于翻译起始密码子ATG上游-217bp的位置;预测的PolyA信号位于翻译终止密码子TAG下游+219bp位置。用Fgenesh程序分析得到的CDS序列设计特异性引物用于5′端和3′端RACE PCR反应。根据测序结果,在5′端和3′端分别设计特异性引物进行cDNA全长扩增和基因全长扩增,结果显示cDNA全长扩增和基因全长扩增测序结果与Fgenesh程序分析结果一致。该基因由1203个碱基组成,不含有内含子,编码400个氨基酸。利用程序CD-search（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）对该基因蛋白序列进行了结构域分析,结果显示该蛋白在N-端含有zf-GRF结构域,在C-端含有bZIP结构域,这两个结构域均被发现在许多DNA结合蛋白中,暗示该基因可能是转录因子（TF）。目前对植物炭疽病菌致病机理的研究多集中在cAMP-CPK1信号传导途径,该基因的发现可能为植物炭疽病菌致病相关分子机理研究提供新的见解,有关该基因的功能及由该基因调控的信号传导途径等研究正在进行之中。更多还原