稳定同位素标记辅助的脂质组学用于脂质代谢网络的动态解析

【作者】 李佳； 赵欣捷； Miriam Hoene； Rainer Lehmann； 许国旺；

【机构】 中国科学院大连化学物理研究所 中科院分离分析化学重点实验室；

【摘要】 脂质是一类重要的代谢物,参与能量动态平衡,构筑细胞膜,信号转导等诸多生命过程。脂质组学（Lipidomics）是基于质谱技术的研究脂质代谢的有力手段。然而大部分的脂质组学只能获取"快照式（snapshot）"的静态脂质代谢指纹,无法对脂质代谢的动态过程（如合成、转化、降解等）进行深入研究。将稳定同位素标记的前体分子引入实验体系中,可帮助捕获脂质动态代谢信息。经典方法有气相色谱-同位素比例质谱（gas-chromatography-isotope ratio mass spectrometry,GC-IRMS）、基于气相色谱-质谱联用（gas-chromatography mass spectrometry,GC-MS）的质量同位素异构体分布分析（mass isotopomer distribution analysis。MIDA）。上述方法样品预处理复杂,且无法实现分子水平上的MID分析。相反,基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）结合二级质谱（MS/MS）可提高分子特异性。目前有报道,通过LC-MS测定胆固醇酯、磷脂、三酰甘油、鞘脂或酯酰辅酶A等脂质库对稳定同位素前体的吸收,来研究干预下的脂质代谢应答。然而,这些研究只关注少数脂质。鉴于此,我们发展并评价了一种基于稳定同位素标记辅助的脂质组学,并结合非靶向的同位素异构体（isotopomer）筛选的新型策略,以实现对脂质代谢网络的动态过程研究。该策略首先通过细胞培养等方式引入稳定同位素标记的脂质合成前体分子;脂质提取物用超高效液相色谱-高分辨质谱联用以全扫描形式进行脂质组学数据采集;随后对采集的质谱信息以非靶向模式进行同位素异构体的筛选和匹配,检测尽可能多的标记脂质,并获取该标记脂质的相关同位素异构体组成信息。通过计算[¹²C+¹³C]和[¹³C/(¹³C+¹³C)],同时得到脂质代谢指纹（等同于常规的脂质组学）和与动态过程相关联的标记信息。我们发展了相应的自动化程序以辅助该质谱数据的解析过程。在用¹³C全标记棕榈酸([U-¹³C]-palmitate)培养的人类骨骼肌细胞中,我们在>7000离子中检测到692个脂质同位素异构体离子,归属于203个脂质分子,覆盖磷脂酰胆碱（PC）,溶血磷脂酰胆碱（LPC）,磷脂酰乙醇胺（PE）,溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）,磷脂酰丝氨酸（PS）,磷脂酰肌醇（PI）,神经酰胺（Cer）,二氢神经酰胺（dHCer）,已糖苷神经酰胺（HexCer）,鞘磷脂（SM）,二酰甘油（DG）,三酰甘油（TG）共12类脂质。基于稳定同位素标记的MS/MS,有助于确定标记位置,研究合成来源,辅助验证结构鉴定和同位素异构体的匹配。对QC（quality contro1）样本的考察表明该方法稳健可靠重复性好,变异系数（CV）中值在所有脂质的水平([¹²C+¹³C]),和标记脂质的标记比例(¹³C/[¹²C+¹³C])中分别为6.91%和3.74%.该策略成功应用于人类骨骼肌细胞在脂毒性环境下的脂质代谢研究。通过构建包含动态过程的脂质代谢网络,揭示了不同脂质对于过量[U-¹³C]-pahnitate造成的脂毒性下的动态代谢应答过程。综上,我们发展了一种基于稳定同位素标记辅助的脂质组学,并结合非靶向的同位素异构体（isotopomer）筛选的新型策略,在获得静态脂质代谢指纹的同时,可以捕获包含其中的动态代谢过程。该方法具有高度的分子特异性和广泛的网络覆盖能力,方法重复、稳健、可靠,为深入研究脂质代谢开辟了新思路,以期对生物体系的病理生理过程、代谢扰动获得更深刻全面的理解。更多还原