玉米芯水解液中产聚苹果酸菌株适应性进化及聚合途径基因克隆

【作者】 邹祥； 吴小燕； 涂光伟； 昝占全；

【机构】 西南大学药学院； 重庆药物过程与质量控制工程技术中心；

【摘要】 聚苹果酸(polymalic acid,PMA)是一种由出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)代谢产生的生物高分子聚合物,可作为生物可降解材料用于药物缓释载体、吸水材料及农业等领域;苹果酸是重要的食品添加剂和生物炼制C4平台化合物。传统苹果酸生产主要由来源于化石资源的富马酸经酶转化生产,资源受到限制;发酵法直接生产苹果酸缺乏竞争力,本课题组前期建立了聚苹果酸酸水解制备苹果酸新工艺技术(Biotechnology and Bioengineering,2013:110:2105-2113)。为提高出芽短梗霉菌种对玉米芯水解液中毒性物质的耐受能力,以A.pullulans CCTCC M2012223为出发菌株,采用固定化纤维床反应器技术进行重复分批发酵试验,并逐级提高初始水解糖浓度,通过9批次的适应性进化,聚苹果酸得率从0.28g/g提高到0.3g/g;产率由0.29g/L h提高到0.4g/L h。平板分离筛选获得一株驯化菌株,在毒性物质羟甲基糠醛2.5g/L、糠醛0.5g/L、甲酸0.5g/L和乙酸1.5g/L的平板能生长良好,扫描电镜发现,驯化菌株细胞形态发生明显变化。结果表明通过菌种适应性进化策略能有效提高出芽短梗霉对玉米芯水解液中毒性物质的耐受能力,提高菌种的底物转化能力。此外,以苹果酸为底物聚合生成聚苹果酸的聚合途径还不清晰,基于前期文献和生物信息学分析,推测PMA的聚合途径主要涉及苹果酰辅酶A连接酶(malate-CoA ligase)和聚苹果酸合成酶(polymalic acid synthase)的参与。首先对malate-CoA ligase基因进行克隆,通过设计兼并引物,成功克隆PMA合成途径的malate-CoA ligase的核心片段,采用IPCR的原理进一步得到基因全长,生物信息学分析表明该基因全长为1498 bp,分别含有3个内含子和4个外显子,相关基因功能验证及酶学性质正在进行之中。更多还原