栓菌AH28-2漆酶同工酶的诱导、纯化和分子特性研究

【作者】 肖亚中； 吴涓； 张敏； 葛宏华； 陈泉； 王怡平； 施蕴渝；

【机构】 安徽大学生命科学学院微生物与基因技术实验室； 中国科技大学生命科学学院中科院结构生物学开放实验室；

【摘要】 栓菌AH28-2在添加有纤维二糖的液体培养基上经诱导能合成胞外漆酶（Extracellular laccase）。使用3,5-二羟甲苯（3,5-dixydroxytoluene）作为诱导剂时,菌株合成的漆酶同工酶主要活性组分为漆酶B（Lac B）,研究了不同浓度的3,5-二羟基甲苯对菌株生长和漆酶B合成的影响。实验表明,20 mmol/L的3,5-二羟甲苯最有利于漆酶B生成。从3,5-二羟甲苯诱导的发酵培养物制备上清液,经过阴离子交换和分子筛柱层析两个色谱步骤,将主要活性成分漆酶B纯化至SDS-PAGE均一。纯化的漆酶B溶液呈蓝色,在600 nm有一宽吸收峰,330 nm有一肩峰,其280/605 nm光吸收比值为21。原子吸收法和等离子光谱法分别测得漆酶B含有4.1和4.0铜原子/分子蛋白。SDS-PAGE法测得变性酶亚基分子量74 kDa,FPLC法和MALDI-质谱法测得活性酶的分子量分别为72 kDa和71454Da。经N-glycosidase F脱糖法测得其分子中含有25%的碳水化合物。漆酶B的等电点pI为4.0,氧化愈创木酚的最适反应pH为4.75,最适温度为45℃,60℃时的活性半衰期为14.0 min,酶在pH3.5⁷.0范围内稳定性较好。以丁香醛连氮、愈创木酚、ABTS和2,6-二甲氧基苯酚为底物时,测得酶的K_m值分别为28.0,1249.0,177.0和109.8μM,对应的V_max分别为504.0,1910.0,117.4,159.0 u M/min mg。更多还原