西藏扎布耶查卡盐碱湖极端酶资源研究

【作者】 曾艳； 马延和；

【机构】 中科院微生物所极端环境微生物实验室；

【摘要】 本论文尝试通过非培养的方法从盐碱湖土壤样品中获得极端酶资源。我们首先提取了盐碱湖环境样品中的总DNA,然后利用环境总DNA建立了环境DNA文库(metagemoe library),最后通过测序和PCR方法从文库中筛选酶基因或基因片段。对于盐碱湖土壤我们首先进行了透析操作,以除去土壤中盐分并且使土壤粉末化,然后用液氮冻融方法尽可能完全的使所有细胞裂解,接着利用CTAB和PVPP结合的方法除去土壤中的腐殖质成分,最后得到了高纯度的DNA样品。经16SrRNA检测样品中包含了古菌及细菌的D N A,限制性酶切试验证明DNA纯度可以用作分子生物学操作。将所获得的DNA样品经超声波打断后用Klenow酶末端补齐连接到pUC18质粒,转化E.coli DH 10B,建立插入片段为3-6kb的环境基因文库,得到约10,000个克隆。对阳性克隆质粒酶切分析,90%以上的插入片段在3-6kb之间。从基因组文库中随机取96个克隆,对插入片段进行部分测序。测序结果在NCBI网站上进行Standard genomic BLAST检索,同时在KEGG网站进行gene的FASTA(nr)检索,比较预测这些序列所含的开放阅读框或部分开放阅读框可能编码的功能。结果表明其中7个克隆含有与现有的酶基因相似的序列,其中70-1的序列与现有的木聚糖酶序列极为接近。同时对盐碱湖环境样品DNA文库进行了淀粉酶,脂肪酶,木聚糖酶,蛋白酶,海藻酸盐裂解酶、纤维素酶的活性筛选,未得到有酶表达的克隆。可能是来自盐碱菌的基因未能在中性菌中正常折叠从而失活,也可能是我们所建立的文库插入片段不够大未能包含完整的基因簇,从而酶未表达。同时对于活性检测的灵敏度也需要提高。由于目前还没有较为成功的耐碱或者嗜碱宿主菌,所以对于我们的样品而言使用直接测序或者PCR是更为适当的筛选酶基因的方法。本论文成功的建立了从盐碱土样中提取环境DNA的方法,并成功建立了盐碱环境样品的环境DNA文库。目前对于这个基因文库的筛选工作仅在起步阶段,在今后的工作中,我们还需要用不同的方法对其进行进一步筛选。更多还原