嗜硫色谱法分离纯化碱性脂肪酶的研究

【作者】 吴吟妮； 江贤章； 黄建忠； 施巧琴； 吴松刚；

【机构】 福建师范大学生物工程学院；

【摘要】 碱性脂肪酶（EC 3.1.1.3）,是一种具有水解与合成脂肪的界面酶,在轻化工、生物制药、环境保护等领域具有广泛的应用。我院已研制成功了工业级和食品级碱性脂肪酶。开发药用脂肪酶是生物制药的一个方向,但传统的分离纯化技术很难满足药用酶高纯度的要求。嗜硫色谱是利用砜-硫醚基团对蛋白质的特异吸附来进行蛋白质分离纯化的一项前沿技术,具有高特异性、高吸附量、设备简单等优点。本文就嗜硫色谱分离纯化碱性脂肪酶进行了系统的研究,为该酶的晶体学、化学修饰的研究提供了技术保证。1酶蛋白二硫键位的确定对粗酶进行还原与非还原处理,SDS-PAGE（图1）显示前者相对迁移率较后者稍大,表明该酶不含链间二硫键（为单链酶）而含有链内二硫键。可以用嗜硫色谱进行分离纯化。2 Sephacryl S-200凝胶过滤将冻干后的粗酶溶于20mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.5）中,上样到Sephacryl S-200层析柱（Φ26cm×1m,预先用含50mmol/LNa₂SO₄的缓冲液平衡）,收集酶活洗脱峰。SDS-PAGE电泳表明,脂肪酶蛋白（28kD）是主峰而其他两类蛋白（25 kD、39kD）含量较低,条带染色浅。3嗜硫层析（Thiophilic Chromatography,T-gel）将经过凝胶过滤的酶液,加入Na₂SO₄,上样到T-gel。Na₂SO₄浓度是影响脂肪酶T-gel纯化的一个关键因素。当Na₂SO₄浓度为0.5mol/L时,发现洗脱峰（通过C-18疏水反相色谱检查）含有两个组份（图2）,分子量分别为39kD和28kD,这表明39kD的杂蛋白也含有二硫键。当Na₂SO₄浓度为0.4mol/L时,脂肪酶蛋白可被特异性地吸附,集中出现在洗脱峰中;而其他两个杂蛋白则只在穿透峰中出现。当Na₂SO₄浓度为0.3mol/L时,脂肪酶蛋白无法吸附在T-gel上,并随着杂蛋白一起穿过T-gel,没有分离效果。这主要是因为盐浓度太低,未能打开酶的链内二硫键。更多还原