一种新的PyNPase的纯化、性质和基因克隆及其应用研究

【作者】 阮期平； 吴梧桐；

【机构】 中国药科大学生物制药学院；

【摘要】 本课题属生物酶工程应用基础研究领域,旨在建立核苷类抗病毒、抗肿瘤药物筛选及酶促合成的技术平台,为发现和合成新的抗病毒、抗肿瘤药物奠定基础。嘧啶核苷磷酸化酶（PyNPase,EC 2.4.2.2）是嘧啶核苷补救代谢途径中的关键酶,包括尿苷磷酸化酶（UrdPase,EC2.4.2.3）和胸苷磷酸化酶（dThdPase,EC2.4.2.4）两种类型。在无机磷酸存在下,这两类酶能降解嘧啶核苷为核糖-1-磷酸和嘧啶碱,这些降解产物被有机体用作碳源、能源及核酸合成中嘧啶碱基的来源。此外,这两类酶也催化下列转化反应:戊糖-碱基（Ⅰ）+碱基（Ⅱ）=戊糖-碱基（Ⅱ）+碱基（Ⅰ）。在肿瘤细胞中,它们还能改变抗癌药物前体5’-脱氧-5-氟尿嘧啶核苷（5’-DFUR）成为它的活性形式5-氟尿嘧啶（5-FU）。近年来,随着利用能产生核苷磷酸化酶的微生物合成核苷类抗肿瘤、抗病毒药物技术的发展,对于核苷磷酸化酶的研究越来越受到人们的关注。我们通过对产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）进行诱变处理,筛选到一个具有较高5-氟尿苷（5’-脱氧-5-氟尿苷的中间体）转化活性的突变株,并定名为:Enterobacter aerogenes EAM-Z₁。在本课题中,我们首次从PyNPase的分离纯化、酶学性质、基因克隆、酶转化条件优化及转化产物分离等4个方面分别对来自产气肠杆菌突变株EAM-Z1的嘧啶核苷磷酸化酶进行了较为全面的研究。来自.Enterobacter aerogenes EAM-Z₁的细胞提取液经过硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素柱层析、Phenyl-Sepharose CL柱层析、DEAE-Sepharose FF柱层析、Mono-Q FPLC、Sephacryl S-200柱层析,得到一种具有UrdPase和dThdPase两种催化活性的PyNPase。经高效液相色谱和SDS-PAGE测定,该酶的分子量为12.8×104,由3个同型亚基组成（亚基分子量4.3×104）。酶学性质研究表明:该酶在紫外区的最大吸收波长为275nm,分子中含较多的半胱氨酸和天冬氨酸或天冬酰胺,而脯氨酸和色氨酸含量很少,等电点为4.46,N端氨基酸序列为:MRMVDLIATKRDGGE。该酶的最适pH为7.8,最适温度为50℃,且具有较高的耐热性。酶动力学研究表明:该酶的催化机制属"顺序机制"而非"乒乓机制",且当嘧啶核苷作为可变底物时,产物嘧啶碱对酶活性具有竞争性抑制作用;而当磷酸盐作为可变底物时,产物嘧啶碱对酶活性却表现出反竞争性抑制作用。此外,碘乙酸明显抑制该酶的活性,由此说明:—SH在酶活性中心起着重要作用。在催化活性方面,该酶尚具有两个特点:其一,同时具两种酶的催化活性,即尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶活性,对尿苷的K_m为0.24mM,对胸苷的K_m为0.16 mM。其二,既能催化嘧啶核苷磷酸化,又能催化核糖基转移,且具有较高的转化活性。该酶的这些特点对于PyNPase催化机制的研究,酶法合成抗肿瘤、抗病毒药物及筛选新的人dThdPase抑制剂是非常有用的。我们通过以该酶的N端氨基酸序列设计上游引物,以不同来源PyNPase的C末端同源区氨基酸序列设计下游引物,采用PCR技术,扩增出该酶基因的编码区（约1205 bp）,并完成了其重组质粒的构建和核苷酸序列的测定,目前正在进行PyNPase表达质粒的构建。在微生物转化方面,我们首次利用产气肠杆菌EAM-Z₁游离细胞,以尿苷、5-氟尿嘧啶及磷酸盐为底物,在我们摸索的最适反应条件下合成了抗肿瘤药物5’-脱氧-5-氟尿苷的中间体5-FUR,底物转化率达到49%。本课题对产气肠杆菌EAM-Z₁的纯化和培养、酶活测定、产物和底物测定方法的建立进行了深入的研究。结果表明:在摇瓶发酵培养基中加入0.1%葡萄糖可使菌体浓度提高40%,加入0.7%NH₄Cl可明显促进菌体生长,而0.3%Na₂CO₃则抑制其生长。我们也探讨了在不同反应条件下5-氟尿苷的酶促合成,结果表明,产气肠杆菌EAM-Z₁游离细胞以UR和5-FU作为底物合成5-FUR的最佳条件为:最适pH为7.8,最适温度55℃,UR/5-FU为2.8,磷酸盐浓度为30 mM,菌体用量为10%,反应时间为9h。但当磷酸盐浓度大于40 mM时,磷酸盐将抑制底物与PyNPase的结合,降低底物的转化率。微生物转化法合成抗病毒、抗肿瘤药物所面临的一个最关键的技术问题即是转化产物的分离。我们经过2年的努力,探索出一种"干燥柱真空层析"技术。这项技术通过采用三根短硅胶柱（Φ2.5×5.5 cm）和三种溶剂系统,在真空条件下分次洗脱,再经过乙醇精制,得到纯度为98%的5-FUR,其收率为92%。这项技术具有高效、快速、适合于大量制备等特点。更多还原