毛霉△6-脱氢酶基因的克隆与表达

【作者】 黄建忠； 施巧琴； 吴松刚； Yasunari Michinaka；

【机构】 福建师范大学生物工程学院； Department of Molecular Biotechnology,Graduate School of Advanced Science of Matter,Hiroshima University；

【摘要】 γ-亚麻酸是一种具有重要生理功能的ω-6高度不饱和脂肪酸。许多的丝状真菌如Mortierella isabellina,Mortierella ramanniana和Mucor circinelloides都可大量合成γ-亚麻酸。γ-亚麻酸(GLA,C18:3□^6,9,12)是由□⁶-脂肪酸脱氢酶以亚油酸(LA,C18:2□^9,12)为底物,在C₆位脱氢形成的。△⁶-脱氢酶是γ-亚麻酸生物合成的关键限速酶。克隆该酶具有重要的理论和应用价值。我们以γ-亚麻酸高产菌株Mucor circinelloides为材料,成功克隆了△6-脱氢酶基因并实现其在酵母中的表达。1.△6-脱氢酶基因的克隆根据已知的动植物和微生物的脂肪酸脱氢酶的氨基酸保守序列WWKDKHNTHH和QIEHLFPSM,设计了两个简并引物Pl(5-TGGTGGAAGGATAAGCA（C/T）AA（C/T）ACTCA（C/T）CA-3和P2（5-CAT（A/G）GT（A/G）GGGAA（A/G）AG（A/G）TG（A/G）TG（C/T）TC（A/G）ATTTG-3）。通过RT-PCR和5-RACE技术方法路线,获得了△6-脱氢酶基因完整的cDNA序列。cDNA序列全长为1188bp。编码396个氨基酸,其推导的酶蛋氨基酸序列与来源于Mortierella alpina和borage的△6-脱氢酶分别呈现45.2%和25.9%的相似性。该酶具有多数脱氢酶所具有的三个组氨酸Box和两个疏水区。但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是,□⁶-脂肪酸脱氢酶在其序列的N端特有细胞色素b5（Cytb5）区。2.基因功能的确定cDNA连接到酵母表达载体pYES2.O（URA3;Invitogen）。重组质粒pYD6用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1中（α/a his3 leu2 trpl ura3;Invitrogen）,在SC-Ura合成培养基中,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,获得阳性克隆子。通过G-C-MS对酵母工程株所含的全部脂肪酸进行色谱分析。结果表明,γ-亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的13.8%。该酶在亚油酸△6位上的脱氢作用得到了证实。3.细胞色素b5对毛霉△6-脱氢酶基因的表达的影响毛霉△6-脱氢酶基因在含有细胞色素b5的酵母细胞中的表达明显强于缺乏细胞色素b5的表达酵母。在细胞色素b5的存在下,表达产物与底物比值（γ-亚麻酸/油酸）为2.14,高于没有细胞色素b5条件下的γ-亚麻酸/油酸比值（1.20）。构建的含有双基因（△6-脱氢酶基因和细胞色素b5基因）的重组质粒无论在野生型酵母还是细胞色素b5缺陷型酵母中的表达都显著高于△6-脱氢酶单基因的表达。4.基因的点突变:△6-脱氢酶53位的组氨酸被丙氨酸替代,该酶就失活;但52位的精氨酸被替换后,酶活依旧保持。更多还原