南极海冰细菌的硫氧还蛋白(Trx)基因克隆、表达及功能分析

【作者】 王全富； 史永磊； 侯艳华； 杨洋； 严天奇； 曲俊杰；

【机构】 哈尔滨工业大学,海洋科学与技术学院；

【摘要】 硫氧还蛋白系统是生物体内重要的抗氧化系统之一,主要包含有硫氧还蛋白（Trx）、硫氧还蛋白还原酶（TrxR）和NADPH,该系统通过调节酶活性、转录因子、各种胁迫应答和信号传导等,在生物抗逆系统中起着重要的作用。南极由于其独有的地理及气候特征,形成了一个干燥、酷寒、强辐射的自然环境,蕴育了丰富的微生物资源。在长期的进化和生长过程中,微生物形成了极为独特的基因资源、遗传背景及新的代谢特征。本研究以南极海冰细菌Pseudoalteromonas sp.为材料,对硫氧还蛋白系统中的重要成员Trx的基因进行了克隆、异源表达以及抗逆研究,以期进一步完善南极微生物低温适应性的分子机制,获得具有自主知识产权的功能基因,为抗逆生物遗传育种提供新的基因。本研究从海冰细菌ANT178中克隆出Trx全长基因（PsTrx）,利用生物信息学方法分析其基因序列,推测蛋白分子量约为11.9kDa,等电点为4.50。对氨基酸序列进行结构分析,推测其关键活性位点为Cys33和Cys36,对蛋白的结构进行同源建模,其结构中含4个α-螺旋和5个β-折叠。对PsTrx的氨基酸序列进行比对分析,发现该蛋白属于Trx家族,具有保守的催化位点WCGPC序列。PsTrx基因转入E.coli BL21后,实现了异源表达,采用Ni-亲和层析纯化PsTrx,并用比浊法测定纯化的表达产物还原牛胰岛素α与β链之间二硫键的活性。与大肠杆菌相比,转入PsTrx的重组大肠杆菌可在一定浓度的盐胁迫逆境下高产量生长,在盐度为9%培养条件下,其最大OD₆₀₀吸光值可以达到1.316,而野生型大肠杆菌的OD₆₀₀仅为0.393。利用FQ-PCR相对定量2^-ΔΔ^Ct法测定不同盐度下海冰细菌PsTrx表达情况,高盐度下（5%-9%NaCl）的PsTrx表达量高于对照组（3.3%NaCl）,其中9%盐度下的表达量是对照组的2.5倍,这表明PsTrx基因在菌体的耐盐机制中起着重要作用,进而可为耐盐遗传育种提供新的基因。更多还原