潜在新细胞因子FAM19A4在CHO细胞中的高效稳定表达

【作者】 刘绘绘； 王文彦； 石爽； 惠觅宙； 陈英玉； 韩文玲；

【机构】 北京大学医学部免疫学系,卫生部医学免疫学重点实验室； 北京大学人类疾病基因研究中心；

【摘要】 研究背景:FAM19A4是通过免疫基因组学策略发现的新的潜在细胞因子,它是一个经典分泌蛋白,在各组织中广泛低表达,但是在LPS刺激的单核-巨噬细胞和M1型细胞中表达上调。体内和体外研究发现FAM19A4可以提高巨噬细胞对zymosan的吞噬能力,并显著提高Akt的磷酸化水平,同时促进zymosan引起的ROS释放。进一步研究还发现FAM19A4对巨噬细胞具有趋化活性,通过趋化实验、受体内化、放射性结合分析和受体封闭等实验,首次发现FPR1是FAM19A4的一个受体。综上FAM19A4可能是一个在感染性疾病中发挥重要作用的潜在新细胞因子。哺乳动物细胞表达系统可产生具有较高生物学活性的接近天然蛋白的重组蛋白。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是目前最常用的表达宿主细胞。目的:建立稳定、高效表达人FAM19A4-myc-his融合蛋白的CHO细胞,获得大量重组蛋白,为后续研究奠定基础。方法:从表达FAM19A4-myc-his融合蛋白的载体中扩增其cDNA片段,将其克隆到高效真核表达载体pMH3中(pMH3由杭州安瑞普生物制品研究有限公司提供)。利用电击转染的方法将该质粒转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆,Dot blot及Western blot法鉴定其表达水平。挑选表达较高的一次克隆细胞株进行二次筛选。悬浮驯化后通过小量培养和镍柱富集,挑选表达量最高的一株细胞株扩大培养,使用亲和层析进行纯化,SDSPAGE鉴定其纯度。结果:经核酸测序及酶切鉴定,高效重组FAM19A4表达载体构建成功。此载体转染CHO细胞后经2次筛选获得3株高效稳定表达融合蛋白的CHO细胞株。悬浮驯化后通过小量培养和镍柱富集,表达量最高的一株细胞株可达到8~10mg/L,,Western blot分析显示其分子量约为20kDa,与预期融合蛋白大小基本一致。进而扩大培养到1L,纯化后得到高纯度的FAM19A4重组蛋白6.25mg,收率大于60%。结论:获得了高效稳定表达FAM19A4的CHO细胞株。更多还原