杜梨水孔蛋白基因PbPIP1的克隆与功能分析

【作者】 冉昆； 王少敏； 魏树伟； 王宏伟； 张勇；

【机构】 山东省果树研究所；

【摘要】 水孔蛋白（aquaporins,AQPs）是高效转运水分子的膜内在蛋白,具有丰富的多样性。质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins,PIPs）是其中的一个亚类,在调控植物的水分关系中具有重要作用。杜梨（Pyrus betulifolia Bunge）抗逆性强,广泛用作梨栽培品种的砧木。为了探明水孔蛋白在杜梨干旱胁迫应答中的作用,克隆了杜梨PbPIP1基因的全长cDNA序列并进行了生物信息学分析,研究了其组织表达模式和不同胁迫下的表达模式,分析了过表达PbPIP1基因的转基因拟南芥株系的表型变化及其对干旱胁迫的响应,对阐明杜梨的抗旱机理及未来利用基因工程手段培育高水分利用效率的新种质具有重要意义。以具6⁸片真叶的杜梨幼苗为试材,提取根系总RNA并反转录为cDNA,以其为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆得到杜梨PbPIP1基因的全长cDNA序列。通过DNAMAN 6.0、MEGA6.0.5、GSDS 2.0、WebLogo 3和MEME等生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白的特性。利用半定量RT-PCR和qRT-PCR分析该基因的组织表达模式及在干旱、低温和NaCl等不同胁迫处理下的表达模式。构建pBI121-PbP1P1过表达载体并转化农杆菌GV3101,用花序浸泡法转化拟南芥,通过分析转基因株系的表型变化及其对干旱胁迫的响应来探讨PbPIP1基因的功能。结果表明,PbPIP1基因cDNA全长为1127 bp,编码区含867 bp,共编码289个氨基酸。生物信息学分析表明,PbPIP1具有典型的MIP超家族的保守结构域和质膜水孔蛋白的保守序列。聚类分析表明该基因属于PIP亚家族。半定量RT-PCR分析表明,PbPIPl在杜梨根、茎、叶中均有表达,在根中表达量最高,茎中最少。qRT-PCR分析表明,20%PEG处理24 h,杜梨根系PbPIP1的表达水平随胁迫时间的延长显著上升;但在4℃低温、100 mmol·L^-1NaCl处理下该基因的表达水平差异不明显。经抗性筛选和PCR检测获得转基因阳性拟南芥植株,继续筛选至T3代,从中选取两个代表性株系进行表型分析,发现转基因株系的平均叶片数多于野生型拟南芥,但叶片明显变小。在自然干旱10 d复水6 d后,转基因株系的存活率（92%）远高于野生型拟南芥（18%）。20%PEG处理12 h后,与野生型拟南芥相比,转基因株系中PbPIP1基因的表达水平显著提高;同时,MDA含量显著降低,脯氨酸含量、SOD和CAT活性显著上升。上述结果表明,PbPIP1基因的表达明显受干旱胁迫的诱导,过表达PbPIP1会增强转基因拟南芥的抗旱性。更多还原