苹果花药培养再生植株的倍性鉴定及SSR分析

【作者】 张春芬； 邓舒； 肖蓉； 孟玉平； 曹秋芬；

【机构】 山西省农业科学院果树研究所； 山西省农业科学院生物技术研究中心；

【摘要】 利用花药培养诱导产生胚状体获得纯合基因型株系,对基因型高度杂合的苹果育种及遗传分析有重要意义。通常花药培养后代为染色体倍性水平不同的混合群体,而且可能会有花药壁等体细胞发育而来的再生植株的混入,再生植株倍性以及来源的准确鉴定,是关乎到单倍体育种技术的有效利用及创新种质遗传分析等的重要问题。本研究中对苹果花药培养获得的再生植株利用流式细胞仪进行了倍性分析,同时提取叶片DNA后利用SSR分析鉴定植株来源。5月上旬苹果现蕾后采集不同时期的花簇,用密封袋封好置于冰箱4℃冷藏室进行低温预处理。低温处理后花蕾在超净工作台内用0.1%次氯酸钠灭菌后,用镊子从花蕾内取出花药接种于胚状体诱导培养基,25℃下暗培养,3~5个月后待胚状体长至8~10 mm,转移至再生培养基上进行植株再生。再生植株获得后利用流式细胞仪(Partec,德国)进行倍性分析,同时提取叶片DNA后SSR分析鉴定植株来源。SSR分析所用10个marker为CH02c06、MS14h03、CH04e02、CH03d12、CH05d03、CH01f12、CH03d02、CH03b06、CH03b10和CH04f10。目前获得‘丹霞’、‘富士’、‘嘎拉’、‘红星’、‘千秋’、‘祝光’等品种的再生植株97株,其中60株已成功继代并得到扩增,37株在继代过程中枯死。从两年的流式细胞仪倍性鉴定结果看,花粉植株的倍性在继代培养的过程中不断变化。共检测了41株苹果花药培养再生植株,第一次检测结果显示这些植株中有单倍体(x)2株、二倍体(2x)32株、三倍体(3x)2株、四倍体(4x)3株、单倍体和二倍体的混倍体(x+2x)2株。继代3~4次后再次检测,其中的2株混倍体(x+2x)消失,一株在继代2次后枯死,另一株转变为二倍体。还有一株单倍体表现为继代3~4次后部分植株自然加倍为二倍体,即在后代群体中既有单倍体又有二倍体。由此可以看到能够存活并成功继代扩增的植株最终都表现为整倍体,之后将对获得的花粉植株的倍性继续进行跟踪鉴定,以了解花粉植株在继代培养过程中的倍性变化情况。利用CH02c06、MSl4h03、CH04e02、CH03d12、CH05d03、CH01f12、CH03d02、CH03b06、CH03b10和CH04f10等10个marker对‘红星’和‘千秋’来源的花药培养再生植株进行SSR分析,结果显示所有植株均只扩增出亲本中一个片段,因此可以证实这些植株均是由花粉发育而来。更多还原