抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体噬菌体单链抗体库的构建与筛选

【作者】 韩东刚； 黄丽丽； 段小艺； 郭佑民； 王全颖； 杨广笑；

【机构】 西安交通大学第二附属医院超声研究室； 西安交通大学第一附属医院核医学科； 西安华广生物工程公司；

【摘要】 目的构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)特异性单链抗体库,从中筛选抗EGFRvⅢ特异性单链抗体。方法用pep-3偶联载体蛋白OVA后免疫的BALB/c小鼠,从脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增重链(VH)和轻链(VL)的可变区基因片段。将两基因片段由编码(Gly4Ser)3的linker连在一起,并克隆入噬菌体展示表达载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,构建噬菌体单链抗体库。以pep-3-BSA为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,用ELISA鉴定抗体与EGFRvⅢ结合的特异性。结果经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350bp和320bp,与预期理论值相符。经重组PCR得到大小约780bp的ScFv基因片段。ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为5.0×106的噬菌体抗体库,噬菌体滴度为3.0×104pfu/ml。通过亲和筛选使抗EGFRvⅢ噬菌体单链抗体得到富集,第4轮为第1轮的56倍。在E.coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS-PAGE与Western blot结果显示抗体相对分子质量为28kD左右。ELISA测定结果显示该单链抗体具有结合EGFRvⅢ的特异性。结论成功构建了噬菌体单链抗体库,筛选得到了抗EGFRvⅢ特异性噬菌体单链抗体。该单链抗体的制备为探索针对肿瘤特异性靶点的分子成像探针提供了新思路,期望能够对肿瘤的早期分子影像诊断开辟新的方法。更多还原