SiRNA沉默smpd1对抗小鼠卵及3T3细胞凋亡的研究

【作者】 马芸； 张仁礼； 周灿权； 高军； 欧建平； 闻安民； 陈系古； 邓新燕；

【机构】 中山大学实验动物中心； 广东省人民医院生殖中心； 中山大学附属第一医院生殖中心；

【摘要】 目的:卵巢中生殖细胞对于化疗药物特别敏感,儿童和育龄妇女肿瘤患者常出现卵巢早衰并丧失生育能力.卵母细胞和颗粒凋亡的信号途径是通过活化酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase), 水解鞘磷脂产生神经酰胺(ceramide),作为第二信使启动细胞凋亡.小鼠的 smpd1基因与人高度同源,为探讨用 siRNA 沉默酸性鞘磷脂酶基因(SMPD1)是否可以在体外保护卵细胞免受化疗药物的损害,本实验观察 siRNA 沉默小鼠成纤维细胞和 GV 期卵子 smpd1基因后对化疗药物诱导凋亡的反应.方法:设计合成6条靶向 smpd1基因的 siRNA,用脂质体 lipofectamine2000转染小鼠胚胎成纤维细胞株 NIH3T3,用荧光定量 RT-PCR 法和 western blot 法筛选出高效 siRNA 序列并确定最低有效浓度。NIH3T3细胞转染有效 siRNA 和对照无效 siRNA 后培养液中加入丝裂霉素诱导凋亡,Annexin V-EGFP/PI 双染流式细胞仪检测细胞凋亡率.4～5周龄性成熟前期雌性 NIH 小鼠腹腔注射 PMSG5IU,48h 后卵巢收集 GV 期卵,0.2mMIBMX 抑制 GVBD,显微注射5p120u M siRNA、阴性对照 RNA 或溶解 siRNA 的缓冲液,培养24h 用荧光定量 RT-PCR 和 western blot 分别检测 smpd1 mRNA 水平和蛋白水平的基因沉默情况。培养液中加入丝裂霉素诱导 GV 卵凋亡,Annexin V-EGFP/PI 双染观测注射后各组凋亡情况。结果:用荧光定量 RT-PCR 方法筛选自行设计和定购的6条 siRNA, 发现设计的3号普通19nt siRNA 和 stealth siRNA2号和3号均对3T3细胞内源性表达的 SMPD1基因有明显抑制作用,均超过65%(转染效率约为80%),0.5nm 浓度24h 即有明显沉默的作用,蛋白沉默的时间介于48h 之后.细胞转染 siRNA 后丝裂霉素的诱导凋亡作用明显减轻,空白对照组凋亡率为31%,而 siRNA 3号凋亡率为8.6%,stealth siRNA 2号为7%,差异有显著性意义(p<0.05). GV 期卵注射后24h 使 smpd1 mRNA 下降90%,与未注射和注射阴性对照及缓冲液的卵子相比,注射 siRNA 的卵子对化疗药物诱导的凋亡有明显的抵抗作用。结论:本研究设计筛选出了靶向 smpd1 基因的 siRNA,并验证 smpd1 siRNA 在小鼠胚胎成纤维细胞系和 GV 期卵子中具有一定对抗化疗药物诱导凋亡的作用,为卵巢保护提供靶点及治疗途径。更多还原