柠檬酸杆菌对氟喹诺酮类耐药机制的研究

【作者】 朱梅； 李涛； 许伟； 凌华志； 黄颖； 徐元宏；

【机构】 安徽医科大学第一附属医院检验科；

【摘要】 目的了解临床分离柠檬酸杆菌的耐药性及其耐氟喹诺酮的机制。方法收集2004年1月至2006年9月安徽医科大学第一附属医院临床分离的柠檬酸杆菌52株;聚合酶链反应(PCR)法扩增各组qnr基因以及gyrA、gyrB、parC和parE基因,对扩增产物进行基因测序和同源性比较,以确定qnr基因型,分析DNA旋转酶(gyrA、gyrB)和拓扑异构酶Ⅳ(parC、parE)的喹诺酮耐药决定区的基因突变情况;以qnr基因阳性菌株作为供体菌、E.coli J53AzR作为受体菌进行质粒接合试验;琼脂稀释法测定17种抗菌药物对52株柠檬酸杆菌以及E.coli J53和接合子的最低抑菌浓度(MIC)。结果52株柠檬酸杆菌中有22株细菌检出qnr基因,其中5株菌携带qnrA基因,11株菌携带qnrB2基因,1株菌携带qnrB4基因。挑选2株qnrA基因测序与阴沟肠杆菌qnrA基因(GenBank登录号:DQ983226)的同源性为100%;3株qnrB2基因测序与弗劳地柠檬酸杆菌qnrB2基因(GenBank登录号:AB281054)的同源性均为97%。17个碱基突变导致2个氨基酸的改变。为新发现的一种qnrB基因型(GenBank注册号:EF526508):1株qnrB4基因(GenBank注册号:EF543140)测序与大肠埃希菌qnrB4基因(GenBank登录号:DQ303921)的同源性为100%。细菌同时携带CMY-2型AmpC酶和qnrB2基因以及同时携带TEM、SHV、CTX-M13型ESBLs和qnrB4基因均为国内外首次报道。7株柠檬酸杆菌gyrA、gyrB、parC、pare基因测序结果显示,3株gyrA核苷酸序列与弗劳地柠檬酸杆菌标准菌株ATCC8090(GenBank登录号:AF052253)相应片段的同源性为99%,另外4株细菌gyrA核苷酸序列与大肠埃希菌K12(GenBank登录号:U00096)相应片段的同源性为98%,gyrB、parC、parE核苷酸序列与大肠埃希菌K12相应片段的同源性分别为98%、95%和88%。5株氟喹诺酮类耐药菌株主要存在gyrA基因Thr- 83→Ile、Ser-83→Leu、Asp-87→Asn和parC基因Ser-80→Ile、Glu-84→Glv的突变。gyrB基因Leu-417→His和parC基因Lys-127→Arg为新发现的突变位点.与氟喹诺酮类耐药性无关。parE未发现氨基酸的改变。只有一株细菌qnrA基因接合试验成功。52株柠檬酸杆菌对左氧氟沙星、环丙沙星和加替沙星的耐药率分别为84.6%、86.5%和76.9%.接合子对15种抗菌药物的MIC均有不同程度的降低。结论qnr基因的单独存在仅导致低水平的喹诺酮耐药,对氟喹诺酮类敏感。Onr蛋白通过减少DNA旋转酶与DNA的结合达到降低喹诺酮类药物作用的全酶-DNA靶位.从而保护DNA旋转酶不被喹诺酮类抑制.并且含qnr基因的菌株在喹诺酮药物的选择压力下容易发生染色体突变.导致高水平耐药.所以qnr基因的存在对靶位的改变、外排泵激活及外膜膜孔通道蛋白的缺失等染色体突变所致的耐药起补充作用。此次研究柠檬酸杆菌临床分离株中qnr基因检出率较高,应引起高度重视。更多还原