大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的体外实验研究

【作者】 王新平； 任宁； 张文治； 苏心；

【机构】 天津市环湖医院神经内科； 天津市环湖医院细胞室；

【摘要】 目的:探讨抗氧化剂二甲基亚砜(DMSO)/丁羟茴醚(BHA)和脑源性神经营养因子(BDNF)/碱性成纤维2细胞生长因子(bFGF)/全反式维甲酸(AT-RA)两种诱导方法对Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞诱导分化的作用。方法:采用贴壁培养法体外培养、纯化MSCs,并用流式细胞术进行细胞表型鉴定,测定CD90、CD31、CD34阳性细胞百分率。采用抗氧化剂(2％DMSO和200 umol／L BHA)和细胞因子(10 ug／L BDNF和20 ug/L bFGF)/全反式维甲酸 (1umol／L AT-RA)两种诱导剂分别对MSCs进行体外诱导,促其向神经元分化,倒置显微镜下观察诱导后细胞形态变化, 胎鼠皮肤成纤维细胞作为阴性对照组;用逐格摄影方法观察抗氧化剂(DMSO／BHA)分别诱导MSCs和胎鼠皮肤成纤维细胞0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min时细胞形态变化,以及诱导2．5 h时换入普通培养液后0 min、15 min、30 min、60 min细胞形态变化。免疫细胞化学方法检测诱导前后神经前体细胞、神经元和神经胶质细胞特异标记物如nestin, MAP-2,NSE和GFAP的表达。用全细胞膜片钳技术对诱导前MSCs和诱导后神经元样细胞进行电生理功能鉴定,以急性分离的大鼠海马神经元作为阳性对照组。结果:培养第3代MSCs经流式细胞仪检测,显示MSCs的均一性达95％,三个细胞表型的阳性标记率分别是:CD90:99％,CD31:3．4％,CD34:0．3％。抗氧化剂(DMSO和BHA)在0．5 h内即可诱导MSCs 产生神经元样细胞,4 h诱导率最高为86．47％±5．56％,细胞因子(BDNF,bFGF)/全反式维甲酸(AT-RA)24 h内方可诱导出神经元样细胞,72 h诱导率最高为24．01％±3．76％,两组诱导率有显著差异(P<0．01);抗氧化剂(DMSO和BHA)诱导胎鼠皮肤纤维细胞同样产生了神经元样细胞,细胞因子(BDNF和bFGF)／全反式维甲酸(AT-RA)诱导72 h未诱导胎鼠皮肤纤维细胞产生神经元样细胞。逐格摄影观察抗氧化剂(DMSO和BHA)诱导MSCs和胎鼠皮肤成纤维细胞0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min,细胞胞体逐渐收缩生成类似神经元“突起”,而产生神经元样细胞,诱导2．5 h后换入普通培养液后0 min、15 min、30 min、60min,神经元样细胞逐渐恢复为诱导前细胞的形态。诱导前MSCs nestin呈阳性,NSE呈弱阳性,MAP-2和GFAP呈阴性。两种方法诱导后均呈现nestin呈阳性,NSE呈强阳性,MAP-2和GFAP呈弱阳性。抗氧化剂组神经元样细胞电流诱发出现率明显低于未诱导MSCs组和细胞因子(BDNF和bFGF)/全反式维甲酸(AT-RA)组(P< 0．01)。与作为阳性对照的海马神经元不同,两种方法诱导的神经元样细胞均未发现内向电流。细胞因子(BDNF和bFGF)/ 全反式维甲酸(AT-RA)组神经元样细胞外向电流峰值及最大外向电流密度高于抗氧化剂(DMSO和BHA)组和未诱导 MSCs组(P<0．01),抗氧化剂(DMSO和BHA)组较未诱导MSCs组没有显著性差异(P>0．05)。结论:MSCs能够成功地在体外分离、培养,其CD90表达率为99％。抗氧化剂(DMSO和BHA)诱导方法不能诱导MSCs向神经元方向分化。细胞因子 (BDNF和bFGF)/全反式维甲酸(AT-RA)诱导方法可以诱导MSCs向神经元方向分化。诱导MSCs产生的神经元样细胞表达神经元标志物,虽未发现具有成熟神经元电生理功能,但有向成熟神经元分化的趋势。膜片钳技术对诱导MSCs产生的神经元样细胞电生理功能评价具有重要意义。更多还原