慢病毒载体介导Ang-1基因修饰的骨髓间质干细胞移植治疗脑梗死

【作者】 陈柏龄； 张志坚； 黄东煜； 吴秀丽； 王伟；

【机构】 福建医科大学附属第一医院神经内科；

【摘要】 目的:利用慢病毒载体的介导获得表达血管生长素-1(Angiopoietin-1,Ang-1)的大鼠骨髓间充质干细胞 (rMSCs),经股静脉移植入大脑中动脉栓塞大鼠,观察rMSCs在脑内存活、分化情况,及对病灶组织结构和神经功能的治疗作用。方法:提取大鼠胎盘总RNA,通过RT-PCR技术获得大鼠Ang-1基因编码区(CDS)片段。构建慢病毒载体质粒 PNL-Ang1-IRES2-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。PCR 方法检测病毒基因组中Ang-1基因的插入。制备浓缩慢病毒颗粒感染经体外扩增,流式细胞术鉴定的rMSCs。细胞RT- PCR检测Ang-1 mRNA表达,免疫细胞化学和Western Blot检测Ang-1蛋白的表达。CAM鸡胚尿囊膜实验和rMSCs与内皮细胞共培养法检测所表达Ang-1在体外的促血管生成作用。运用改良Zea Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型,随机分为对照组,Angl-rMSCs组及PNL-rMSCs组。栓塞后24h分别经股静脉注射0．1M磷酸盐缓冲液(PBS),Angl- rMSCs细胞悬液以及PNL-rMSCs细胞悬液各1 ml。各组大鼠分别于术后24h及移植后1W应用modified Neurological Severity Scores(mNSS)评价神经功能状况,同时应用免疫荧光化学技术检测Ang1-rMSCs和PNL-rMSCs在脑内存活、表达及分化情况。结果:Ang-1基因测序结果与Genbank报道序列一致。慢病毒载体质粒PNL-Ang1-IRES2-EGFP经SalI和 BamHI双酶切后电泳显示1512bp Ang-1目的基因片段和10．5kb PNL-IRES2-EGFP载体片段。制备的病毒颗粒滴度达 6．7×107TU／ml。病毒基因组PCR证实Ang-1基因插入。荧光显微镜观察到EGFP表达。细胞RT-PCR检测到Ang-1 mRNA表达。免疫细胞化学和western blot检测到Ang-1蛋白表达。接种Angl-rMSCs的CAM与对照组相比,血管分支明显增多。与Angl-rMSC共培养的内皮细胞生长状况明显优于与rMSCs共培养组．尤以>40％浓度时为明显。静脉移植后,与对照组相比,PNL-rMSCs及Angl-rMSCs移植组大鼠神经功能改善明显,mNSS评分差异有统计学意义(p<0．001),Angl- rMSCs移植组的神经功能改善较PNL-rMSCs移植组更为明显,mNSS评分差异亦有统计学意义(p<0．001)。移植后1W HE 染色组织学观察,与对照组相比两移植组梗死区脑组织结构恢复较好。Angl-rMSCs和PNL-rMSCs移植组在荧光显微镜下均可观察到EGFP阳性细胞在梗死区及其周边区聚集并存活,其中Angl-rMSCs移植组中存活细胞大量表达Ang-1,两移植组中均有部分细胞同时表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)或星型胶质细胞标志物神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等。结论:成功构建带有Ang-1基因的慢病毒载体,并成功实现Ang-1基因在rMSC中的表达。其表达的Ang- 1在体外具有促进血管生成的活性。经静脉移植后Angl-rMSCs能迁移至大鼠损伤脑组织区域,在此存活并分化,表达神经细胞特异表型NSE、NF、GFAP。移植后rMSCs与Ang-1可促进脑梗死后神经功能恢复,推测具有协同作用。此为将来Ang-1修饰的基因工程干细胞移植治疗脑梗死的研究提供了实验依据。更多还原