慢病毒载体介导Bdnf基因修饰的骨髓间质干细胞移植治疗脑梗死

【作者】 黄东煜； 张志坚； 陈柏龄； 吴秀丽； 王伟；

【机构】 福建医科大学附属第一医院神经内科；

【摘要】 目的:利用慢病毒载体介导获得Bdnf基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs),并经静脉移植入大脑中动脉栓塞大鼠,观察其在脑内存活、分化情况,及对病灶组织结构和神经功能恢复的作用。方法:提取大鼠海马总RNA,通过 RT-PCR技术获得大鼠Bdnf基因编码区(CDS)片段。构建慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。提取近交系F344大鼠新鲜骨髓,体外分离rMSCs 并培养、流式细胞仪鉴定。浓缩病毒测定滴度后感染2-4代rMSCs,荧光激发观察,细胞化学染色及RT-PCR以鉴定感染后 rMSCs中BDNF的表达情况。运用改良Zea Longa的线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型,随机分为对照组、Bdnf-rMSCs 组及空载体-rMSCs组。栓塞术后24h经尾静脉,对照组注射0．1M磷酸盐缓冲液(PBS)1ml,Bdnf-rMSCs和空载体-rMSCs 组分别注射Bdnf-rMSCs细胞悬液以及空载体-rMSCs细胞悬液各1 ml。各组大鼠分别于术后24h及移植后1w应用 modified Neurological Severity Scores(mNSS)评价神经功能状况,同时应用荧光激发及免疫组化技术检测Bdnf-rMSCs和空载体-rMSCs在脑内存活、表达及分化情况。结果:Bdnf基因测序结果与Genbank报道序列完全一致。构建的慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP经双酶切测序鉴定正确,三质粒共转染293T细胞后荧光激发可见大量绿色荧光,收集、浓缩病毒测定滴度为6．7×107 TU/ml,提取病毒基因组经PCR证实Bdnf基因插入。感染后rMSCs经荧光激发可见绿色荧光,RT-PCR检测示Bdnf-rMSCs组BDNF mRNA水平表达较空载体-rMSCs组及rMSCs组高(p<0．001),细胞化学检测 Bdnf-rMSCs组确有大量BDNF蛋白表达。静脉移植后,与对照组相比,空载体-rMSCs及Bdnf-rMSCs移植组大鼠神经功能改善明显,mNSS评分差异有统计学意义(p<0．001),而两移植组间mNSS评分差异亦有统计学意义(p<0．001),Bdnf- rMSCs移植组明显优于空载体-rMSCs移植组。移植后1W HE染色组织学观察,与对照组相比两移植组梗死区脑组织结构恢复较好。Bdnf-rMSCs和空载体-rMSCs移植组在荧光激发下均可见EGFP阳性细胞在梗死区及其周边区聚集并存活,其中Bdnf-rMSCs移植组中存活细胞大量表达BDNF,两移植组中均有部分细胞同时表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)或星型胶质细胞标志物神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等。结论:成功构建带有Bdnf基因之慢病毒载体,并借此获得Bdnf-rMSCs基因工程干细胞,该细胞可大量表达BDNF蛋白。Bdnf-rMSCs经静脉移植后能迁移至在宿主脑内损伤区,存活、分化表达神经细胞特异表型NSE、NF、GFAP。移植后rMSCs与BDNF可协同作用促进脑梗死后神经功能恢复,这为将来基因工程干细胞移植治疗脑梗死提供了理论依据。更多还原