HBV RNA上La protein结合位点的缺失对自身稳定性的影响

【作者】 林园园； 林菊生； 王晓燕； 谢娜； 周秀敏； 宋宇虎；

【机构】 华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所；

【摘要】 目的研究乙型肝炎病毒(HBV)DNA上的突变所造成HBV RNA上La protein结合位点的缺失对HBV RNA 在宿丰细胞内稳定性的影响,评价HBV DNA上这个位点对HBV生命周期的重要性,从而寻找新的抗HBV靶点。方法应用 PCR,分子克隆和定点突变技术,针对La protein与HBV RNA结合的相关位点,构建缺失了La protein结合相关位点的HBV 突变载体,命名为pHBV-mLa;通过计算机预测突变后,这段序列所在的HBV RNA片段的二级结构;应用脂质体将未突变的 HBV载体和HBV突变载体分别瞬时转染入HepG2细胞株中;半定量RT-PCR检测HBsAg mRNA和HBeAg mRNA,ELISA 检测HBsAg和HBeAg表达情况。结果酶切鉴定和碱基测序证明,成功构建了La protein结合相关位点部分碱基缺失的HBV 突变载体——pHBV-mLa;突变后的HBV RNA二级结构同突变前的比较,完全改变;转染后半定量RT-PCR检测,发现突变后HBV HBsAg mRNA和HBeAg mRNA水平均明显降低,ELISA检测发现突变引起HBsAg和HBeAg表达下调。结论由于HBV DNA上的人工突变,所引起的HBV RNA上La protein结合位点相应的改变,使得HBV RNA特殊的二级结构改变, 导致La protein与HBV RNA结合松弛、解离,无法保护HBV RNA(HBsAg mRNA和HBeAg mRNA),RNA酶就可以引起 HBV RNA的降解,从而使HBV RNA水平降低,影响HBV各种蛋白的表达。本实验表明,在HBV DNA上,这个位点碱基序列的保守性使HBV RNA可以形成特殊的二级结构,这个结构影响着HBV RNA在宿主细胞内的稳定性,所以HBV DNA 上这个位点的存在和保守对HBV生命周期至关重要。更多还原