干细胞因子对骨髓间充质干细胞的促增殖、分化作用

【作者】 郭军； 林国生； 贾光宏； 杨波； 汪蕾；

【机构】 武汉大学人民医院心内科；

【摘要】 目的本实验旨在探讨干细胞因子(SCF)促进骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖及促进其向心肌细胞分化的作用。方法将SD大鼠随机分成SCF组和对照组,每组12只。SCF组用rhSCF(20μg·k-1·-1)连续5天皮下注射,对照组用等剂量的生理盐水连续5天皮下注射,第7天处死大鼠。取股、胫骨的骨髓液,加入培养基,接种于35mm培养皿,CO2培养箱培养。通过不断的换液与传代逐渐纯化扩增MSCsI流式细胞仪检测第4代细胞周期。胶原酶加胰蛋白酶共同消化了支分离乳鼠的心肌细胞,培养3天。用DAPI(25g/ml)标记第4代MSCs流式细胞仪检测第4代MSCs,2小时后将DAPI标记的MSCs皿用D-hanks液洗十遍,与未标记的培养第3天的心肌细胞按细胞数量比1:2混匀,按5×104个/cm2接种于覆盖有盖玻片的24孔板。在共培养的第1天至第5天每组每一时间点各取两个孔的盖玻片,用免疫荧光技术及数码显微摄像分别检测和记录心肌特异性肌节肌球蛋白重链(MHC)、肌钙蛋白T(Tn T)的表达。每组每一时间点随机取12个非重叠视野(×100),计数即有胞浆发出红色荧光又有胞核发出蓝色荧光的细胞数量(即表达TnT或MHC的MSCs的数量)及所有胞核发蓝色荧光的细胞数量(即DAPI-MSCs的数量),两者相比取平均值即为向心肌样细胞分化的DAPI-MSCs百分率。数据以均数±标准差表示,采用t检验,用SPSS软件进行统计学处理。结果(1):MSCs细胞周期检测结果:SCF、组的G0/G1期细胞百分率均显著低于对照组(P<0.01),S期、G2/M期细胞百分率及增殖指数(PI)均显著高于对照组(P<0.01)。(2)共培养后MSCs向心肌细胞分化:SCF组和对照组的MSCs均于共培养的第1天就开始表达心肌特异性MHC蛋白,但没有显著差异;在共培养的第2、3、4、5天,SCF组表达MHC的DAPI-MSCs阳性百分率分别为(1.96±0.33)%、(4.76±0.32)%、(5.15±0.42)%、(8.52±0.45)%,显著高于对照组的(0.52±0.21)%、(1.25±0.47)%、(1.75±0.28)%、(3.64±0.32)%(P<0.01)。在共培养的第3、4、5天表达TnT的DAPI-MSCs阳性百分率分别为(1.10±0.15)%、(2.64±0.18)%、(5.43±0.24)%,均显著高于对照组的0、(1.27±0.13)%、(1.32±0.25)%(P<0.01)。讨论目前考虑的MSCs植入心肌的方式如直接注射、导管介入等对机体均有一定的创伤。而细胞因子动员干细胞的方式简单、无创,为干细胞治疗心血管疾病开创了新的前景。SCF为c-kit原癌基因编码受体的配体蛋白,它参与机体发育中的多种细胞生长的调控,是一种多功能细胞生长因子,在细胞增殖、分化和迁移过程中发挥重要的调控作用。有研究发现MSCs在增殖分化的过程中持续表达SDF-1、C、-M-、SF、G等细胞因子,这些信号分子对MSCs的增殖、迁移、聚集和分化等方面都有促进作用。我们在流式仪检测的结果中发现SCF具有促进MSCs由静止态进入增殖态的作用。我们采用体外模拟心肌微环境的方法,尽可能排除了在体内实验中可能被动员的造血干细胞向心肌细胞分化的干扰,结果发现SCF组表达MHC及TnT的MSCs阳性百分率均显著高于对照组。干细胞因子为MSCs治疗心血管疾病带来了新的曙光,值得深入研究。更多还原