不同组合及组分结核杆菌多价DNA疫苗的保护效率比较研究

【作者】 蔡宏； 余大海； 田霞； 呼西旦； 李淑霞； 朱玉贤；

【机构】 北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室； 新疆畜牧科学院兽医研究所；

【摘要】 牛结核病是一种慢性消耗性传染病,人、畜结核病的交叉感染是造成结核病不断流行的重要原因,尤其是在畜牧业发达的地区,人、畜间结核病的交叉传播,不仅对人类的身体健康造成威胁,且也严重影响了畜牧业的快速发展。本研究针对市场需求,完成了十余种结核杆菌分泌型核酸苗的研制,包括结核分枝杆菌MPT-64(23 kD),Ag85B,ESAT-6,MPT-63,MPT-83,MPT-70,PstⅢ,HSP65,MPT-41,MPT8.4,MPT10.4,MPT-51蛋白基因。制备出高效、安全的牛结核杆菌DNA多价疫苗,用于控制和预防人,牛结核病的传播。对4种不同组合的三价苗,两组四价苗,两组融合基因二价苗组,进行了三次免疫接种以及攻毒实验,经免疫和攻毒实验证实Ag85B和MPT-64的两种融合基因二价苗可诱导小鼠产生较高的体液和细胞应答以及保护性应答。四种三价组合在攻毒后保护率都超过了单价苗,其中编码Ag85B、MPT64、MPT83的三种抗原基因组合保护率最高,达到2.81。其次是编码Ag85B、MPT64和ESAT6的抗原基因组合,保护率为1.89。而单价苗的保护率最高只有0.22,BCG的保护率为1.25。有一组四价苗即Ag85B、MPT64、MPT70和PstS-3的保护效率接近与筛选出的一组最佳的结核杆菌DNA三价苗即Ag85B,MPT-64.MPT-83。Ag85B,MPT64,MPT83三价组合疫苗免疫小鼠,DDA和MPL作为佐剂分别提高了此三价苗的免疫原性和免疫保护效果。攻毒后细菌计数结果显示,添加佐剂的三价苗组小鼠的肺脏和脾脏的载菌量分别比空载体组降低了2～3个数量级,且佐剂DDA组显著优于佐剂MPL组和未加佐剂组。添加佐剂组,特别是DDA组小鼠肺部淋巴细胞相对减少,巨噬细胞增多。因此,DDA作为佐剂能显著提高核酸疫苗的免疫效率。在添加IL-2的Ag85B,MFT64,MPT83三联佐剂组的三种抗原特异的IFN-γ含量都明显高于DDA佐剂组,肺脏和脾脏的载菌数比DDA佐剂组低1个数量级.从而增强了三联苗的保护效率。阳离子纳米包裹剂可避免核酸酶对DNA疫苗的破坏,减少疫苗用量和疫苗免疫次数。免疫保护效果与未包被的三价苗组三次免疫的结果相近。用三价DNA疫苗Ag85B、MPT-64和MPT-83添加DDA组及非佐剂组对牛进行免疫以及强毒攻击实验研究结果表明:牛结核杆菌三价DNA疫苗佐剂组三免后2个月,特异针对Ag85B,MPT-64和MPT-83抗原的γ-干扰素水平较阴性对照组有明显的差异P<0.05或P<0.01,攻毒后2个月Ag85B,MPT-83抗原的γ-干扰素水平较阴性对照组有明显的差异。佐剂组与非佐剂组的抗体水平和γ-干扰素水平在三免后两个月达到高峰。细菌计数结果显示:佐剂组中淋巴结的减菌数较非佐剂组明显,但肺部的载菌量差异不明显。用该三价疫苗对牛进行两次初始免疫后用BCG的加强免疫以及强毒攻击实验结果表明:免疫牛的体液和细胞应答明显加强,针对Ag85B,MPT-64,MFT-83抗原特异性的抗体水平提高了2-4倍。外周血T细胞产生的针对Ag85B,MPT-64,MPT-83抗原特异性的INF-γ的水平较对照组比较差异显著(P<0.05或P<0.01)。此外,对外周血T细胞增殖情况进行了检测并对T细胞亚群进行了细胞流式分析发现,用BCG进行加强免疫组T细胞增殖显著,CD4+和CD8+T细胞均参与了免疫应答反应,但CD4+T细胞占主导。现正对筛选到的DNA组合疫苗进行试验。更多还原