人抗菌肽FALL-39定点突变以及功能的研究

【作者】 万莉红； 杨云霞；

【机构】 四川大学华西基础医学与法医学院；

【摘要】 目的:在已经构建人抗菌肽FALL-39的原核表达系统(pGEX-1 T-FALL-39)的基础上,用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体,并比较研究FALL-39及其突变肽的功能。方法:采用PCR体外定点突变技术,用赖氨酸替代第24位的谷氨酰胺和第32位的天门冬氨酸,构建FALL-39突变体大肠杆菌表达载体;该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切、胶回收和高效液相色谱分离纯化,获得高度纯化的重组FALL-39以及突变肽:对纯化产物进行的MEC、MIC、MBC和溶血性实验等比较抗菌作用以及对红细胞膜的溶解性。结果:PCR定点突变法得到突变体质粒pGEX-1 T-FALL-39-Lvs24′32,经提取纯化可得到高纯度的活性蛋白FALL-39和FALL-39-Lys24′32(约4Kd)。突变后的FALL-39蛋白对大肠杆菌ATCC 25922和耐氨苄青霉素ML-35p的抗菌活性明显增强。突变后FALL-39蛋白在抗菌剂量时对红细胞的溶解作用未见明显增加,较大剂量时对红细胞的溶解作用略有增加。结论:用高保真的Polybest DNA多聚酶进行一步法PCR定点突变技术简单、有效;突变质粒表达分子的抗菌活性和抗内毒素明显增强,对红细胞的溶解作用在抗菌剂量时未见明显增加,较大剂量时略有增加,提示在FALL-39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性。更多还原