中药对雄性动物生殖毒性的体内外试验方法研究

【作者】 张晶璇； 王鹏； 徐湘婷； 马璟； 钱蓓丽； 杨继红；

【机构】 上海医药工业研究院-国家上海新药安全评价研究中心； 昆明医学院-云南省天然药物药理重点实验室；

【摘要】 目的:探索中药对雄性动物生殖毒性的试验方法。方法:体外试验:建立体外SD 大鼠原代睾丸支持细胞／生精细胞的混合培养和支持细胞的培养系统,选择临床已发现具有男性生殖毒性、从昆明山海棠分离出来的两种主要有效成分-雷公藤甲素(Triptoliede,TL)和雷公藤次碱(Wilforine,WR)作为供试品,用MTT法检测不同浓度的TL和WR对培养细胞增殖的影响,应用免疫细胞化学技术检测两种受试物对培养细胞广谱钙粘素(pan-cadherin) 和卵泡刺激素受体(fshr)表达的影响,验证体外试验方法。体内试验:选择临床已发现有男性生殖毒性的骨风宁(主要成份为昆明山海棠)SD大鼠经口灌胃给药3个月后,观察睾丸的组织病理学变化以探讨其雄性生殖毒性。结果:TL对体外混合培养细胞的最低有毒浓度为 10 μg·L-1,IC50为1．22 mg·L-1;TL对培养支持细胞的最低有毒浓度为10 μg·L-1,IC50为28．15 mg·L-1;并均呈剂量依赖性。WR对培养支持细胞的最低有毒浓度为105 μg·L-1,IC50=139．26 mg·L-1;WR对混合培养细胞无毒性作用。在TL 0．1,1和10 μg·L-1浓度水平时混合培养细胞 pan-cadherin的表达上调;TL各组与溶剂对照组相比对培养支持细胞中pan-cadherin和fshr 的表达无统计学差异;WR各组与溶剂对照组相比对混合培养细胞和培养支持细胞中的 pan-cadherin和fshr的表达无统计学差异。骨风宁给药组SD大鼠睾丸生精细胞减少或消失, 可见多核巨细胞,受损的睾丸中生精上皮处于Ⅰ-Ⅲ期的曲细精管比例增多。给药期末给药组动物睾丸组织中pan-cadherin的表达与对照组无统计学差异,给药期末骨风宁高剂量组动物的睾丸组织中fshr的表达降低。恢复期末骨风宁中、高剂量组动物睾丸组织中pan-cadherin 的表达分别升高和降低,恢复期末给药组动物睾丸组织中fshr的表达与对照组无统计学差异。结论:中药的雄性生殖毒性研究可以联合应用体外试验和体内试验。体外试验可以用来进行生殖毒物的初步筛选;体内动物实验提供毒性靶器官受损的客观依据。探讨毒性作用机理可以联合体内外两种试验体系进行系统的研究。更多还原