临床分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec基因分型研究

【作者】 赵彩芸； 肖永红； 王珊； 李耘； 刘健； 杨维维； 郝凤兰；

【机构】 北京大学临床药理研究所；

【摘要】 目的金葡萄球菌对甲氧西林耐药是由mecA基因介导的,这种基因是由一种特有的可移动的基因元件所携带,称为葡萄球菌染色体盒Staphylococcal chromosomal cassette(SCCmec),整合在MRSA菌株的染色体上。目前国外采用分子生物学技术对SCCmee基因分类已经分成Ⅰ-Ⅴ 5种不同的类型,在各个分型中又分别有具体的亚型,各型发生的频率不同。SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ主要存在于院内感染MRSA,携带有多重耐药基因, SCCmec Ⅳ型和Ⅴ型的大小要比SCCmec Ⅰ-Ⅲ小得多,主要在社区感染的MRSA。本研究目的是通过对我国多所医院分离到的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究,建立MRSA SCCmec分类方法;了解国内MRSA菌株流行类别,确定我国临床分离到的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)葡萄球菌染色体盒(SCCmec)基因型,为临床防治疾病的流行与控制感染提供依据。方法金黄色葡萄球菌来源于2005年1月至2005年12月全国17家医院分离菌株,共计266株,其中160株为甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌。送检病房主要包括呼吸、血液、感染、普通外科、神经外科、ICU等病房,标本部位包括痰、血、引流液、关节液、脓液、尿液、伤口分泌物等。标准SCCmec分型的阳性对照菌株来源美国Rockefeller University,Hdeminia de Lencastre 教授赠送的6株标准菌株:COL(SCCmec Type Ⅰ)、HPV107(SCCmec Type ⅠA)、BK2464(SCCmec Type Ⅱ)、 ANS46(SCCmec Type Ⅲ)、HU25(SCCmec Type ⅢA)、BM18(SCCmec Type Ⅳ),质控菌株ATCC29213。抗菌药物标准品包括:苯唑西林、甲氧西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢西丁、头孢噻肟、头孢吡肟、亚胺培南、红霉素、四环素、米诺环素、克林霉素、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星、莫西沙星、利福平、SMZco、万古霉素、替考拉宁。MIC测定:采用标准平皿二倍稀释法。将金黄色葡萄球菌接种在MH肉汤培养基,35℃孵育16-20h。被试菌悬液用多点接种仪接种,每点接种量为 104CFU。抗菌药物测定浓度范围256-0．016 mg／L。根据2002年Oliveira DC实验方法合成9对随机引物,扩增的产物长度与目的基因为495bp(pls), 284bp(kdp),209bp(mecI),342bp(dcs),243bp(pI258,Tn554), 3414bp(Tn554,orfX),81bp(IS431,pUB110),303bp(IS431,pT181),160bp(mecA);PCR扩增反应体系:40μL 反应体系内含20μL 2×Taq PCR MasterMix,MgCL2,模板DNA,根据文献加入不同量的引物(浓度 400-1000nM),补水至总反应体积40μL。反应条件:94℃预变性4min;然后94℃变性30s,53℃退火30s, 72℃延伸1min,30个循环;再72℃后延伸4min;琼脂糖浓度2％,每孔加样量为2μL PCR扩增产物,0．5×Tris- 硼酸-EDTA缓冲液电泳(电压80V),0．5ug/ml溴化乙啶染色,在紫外线下观察产物片段。结果 266株金黄色葡萄球菌对多种抗生素呈现不同程度的耐药。苯唑西林的MIC值范围是0．125->256mg／L,耐药率63．9％, 甲氧西林的MIC值范围是0．25->256mg／L,耐药率62．0％,头孢西丁的MIC值范围是2->256 mg/L,耐药率 62．8％,其它抗生素耐药率在42．5％-84．2％,但米诺环素耐药率为7．5％, SMZ/TMP的耐药率为21．1％。所有菌株对万古霉素和替考拉宁敏感,未发现对万古霉素中间耐药的菌株。266株金黄色葡萄球菌中,MRSA 菌株为160株,占临床分离菌株的60．2％。MRSA菌株对抗菌药物耐药性明显高于其他药物,对米诺环素耐药率为14．4％,SMZ／TMP耐药率为32．5％。160株MRSA PCR方法分型SCCmecⅡ型1株(0．6％),SCCmecⅡ型的亚型4株(2．5％),SCCmecⅢ型20株(12．5％):主要类型为SCCmec Ⅲ型的含有342bp(dcs)扩增条带的菌株,占MRSA菌株67．5％,该类型与SCCmecⅢ型比较不含有303bp扩增条带,比SCCmec ⅢA型又增加了342bp(dcs)扩增条带,从目前结果分析可能属于SCCmec Ⅲ型的新型变异株,也可能是SCCmec ⅢA型的新型变异株,有待进一步研究;SCCmec ⅢA型11株(6．9％),16株细菌未能分型(10％),未发现Ⅰ型和Ⅳ型。主要分离到的SCCmecⅢ型主要包括的三个类型:含有dcs基因SCCmecⅢ型,完全与文献相符SCCmecⅢ型,以及SCCmecⅢA型,共计139株细菌对23种抗菌药物耐药情况为:对青霉素类以及头孢菌素类、红霉素、克林霉素、四环素均耐药,对亚胺培南耐药率相似。氨基糖苷类SCCmecⅢA型对阿米卡星的耐药率为 54．5％,明显低于另两型,SCCmecⅢ-dcs型的对妥布霉素的耐药率也低于SCCmecⅢ型与SCCmecⅢA,米诺环素的耐药率均较低,三型分别为10．2％、10％、27．3％;喹诺酮类环丙沙星、左氧沙星三型耐药结果相似, 加替沙星、莫西沙星对SCCmecⅢ-dcs型的耐药率明显高于另外两型。利福平主要耐药类型为SCCmecⅢ-dcs 型,SMZ／TMP主要耐药类型为SCCmecⅢ型。结论我国临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以SCCmecⅢ型为主,该类型为多重耐药菌株,基因组成与SCCmecⅢ型及ⅢA型有差异。更多还原