相思子毒素的膜受体研究

【作者】 李丽琴； 陈乐贵； 徐建富； 张瑞华； 鹿晓晶； 林福生；

【机构】 北京药物化学研究所；

【摘要】 <正> 目的:通过相思子毒素的膜受体纯化,并对相思子毒素的膜受体特征进行了解,为阐明其体外毒理机制提供分子基础。方法:研究中探讨了一种溶脱和分离膜蛋白受体的非酶方法,以兔红细胞膜为材料纯化Abrin受体,并对受体的活性及基本特征进行了研究。结果:(1)红细胞膜受体溶脱条件选择:观察了两种去污剂Tri-tonX-100或Chaps及其在不同浓度条件下对Abrin受体溶脱效果和溶脱后活性的影响,前者对膜蛋白的溶脱能力高于后者,但后者溶脱的膜受体活性较高。使用1%Chaps溶脱红细胞膜,溶脱物中杂蛋白少,膜受体总活性高,实验中选择1%Chaps作为兔红细胞膜受体溶脱的最佳条件。(2)膜受体纯化:得到的可溶性蛋白通过Abrin-Sepharose4B亲和柱层析,对Abrin特异结合的蛋白吸附于亲和柱上,用较高浓度的半乳糖进行洗脱,得到2种受体蛋白。(3)膜受体的活性、稳定性、影响因素及基本特征:受体的活性以抑制125Ⅰ-Abrin与兔细胞膜的结合所需的蛋白含量表示。将不同受体系列稀释,作竞争抑制实验,计算IC50值,可溶性受体活性IC50为5.9μg蛋白/ml,纯化受体IC50为1.2μg蛋白/ml。对膜上受体及解离下来的可溶性受体连续两周进行活性测定,结果表明受体活性基本不变,较为稳定;温度影响Abrin对膜受体的结合,在低温条件下结合强烈,随着温度升高而下降;经SDS-PAGE分析,表明1%chaps溶脱液中含有6种蛋白,分子量分别为250KDa,46KDa,36KDa,24KDa,20KDa,16KDa,纯化的受体蛋白分子量分别为46KDa,36KDa。结论:使用1%Chaps溶脱红细胞膜,通过亲和柱层析,得到2种受体蛋白,纯化的受体活性提高5倍。更多还原