慢病毒载体对内含子的保护现象的探究

【作者】 方彧聃； 谢书阳； 龚秀丽； 任兆瑞； 曾凡一； 张敬之；

【机构】 上海交通大学医学遗传研究所；

【摘要】 以艾滋病毒(HIV-1)为基本骨架的慢病毒载体,是上个世纪九十年代末由 Naldini 等通过对 HIV-1基因的功能性删减和分割开发而成。至今,慢病毒载体已研制到第四代,该载体具有既能感染分裂细胞又能感染静息细胞并在宿主细胞稳定表达的优点,是基因治疗、制备转基因动物和研究 HIV-1生物特点的良好工具。HIV-1感染细胞后,通过自身所携带的逆转录酶,将其 RNA 逆转录成单链 DNA,利用细胞本身的 DNA 聚合酶以第一链为模板合成双链, 并整合入细胞的基因组中。整合入基因组中的原病毒通过转录产生 pre-mRNA。此 pre-mRNA 经多种型式的内含子剪切方式产生40多种不同的转录本。在病毒生活周期前期,经内含子剪切所产生的转录本通过 Tap,NXF 介导的出核方式山核,翻译出蛋白(Tat,Rev 等),并在病毒生活周期的各个阶段中起着各自的作用。然后通过 Rev 蛋白与完整的 pre-mRNA 转录本(和单一剪切转录本)上的 RRE 序列结合,经由 Rev/CRM 1介导的非传统的转运方式转运山核,并在细胞内膜将完整的 pre-mRNA 包装成病毒颗粒。因此,HIV-1存在着一种保护内含子不被剪切的机制,以保证其完整的 pre-mRNA 转录本最终被包装成病毒。我们在使用慢病毒载体进行转基因研究过程中发现,该载体具有保护外源基因内含子不被剪切的作用。这一现象存在于病毒水平,宿主细胞水平及转基因动物水平,而且第一个内含子比其下游的内含子更易受到保护。此外,整合了带有内含子原病毒序列的转基因动物却能正常地剪切其内含子并翻译蛋白。此现象是病毒为满足其生理特性,从而获得未被剪切的完整转录本所必需的。为了进一步研究此内含子保护现象,我们将慢病毒载体基本骨架,按其功能切成数段,并分别插入到 CMV 启动子和下游一含有内含子的基因之间。将上述载体分别转入293T 细胞,或同时转入 Rev 表达载体,pLP2。通过 RT-QPCR 对其细胞核和细胞质的 mRNA 转录本中的内含子量和总转录本量分别进行定量,用二者之比来评估保护内含子的能力。研究结果表明,HIV-1的 Leader 具有保护内含子的功能,Rev 通过与 Leader 的结合,而不是过去所报道的与 RRE 的结合,协同保护内含子并帮助其转运出核。同时,我们通过对病毒基本骨架在其生活周期不同阶段的内含子含量进行检测,发现其在转运过程中,即从细胞核转运到细胞质直至在胞膜被包装成病毒的过程中,内含子含量逐级升高。因此,首次提山了 Rev 和 Gag 通过与 pre-mRNA 上的 Leader 结合而进行二次筛选过程的假设,以保证尽可能多的完整的 pre-mRNA 被包装成病毒。更多还原