遗传病宫内治疗的研究-应用改良的干细胞宫内移植方法建立高嵌合率小鼠模型

【作者】 陈欣； 龚秀丽； 曾凡一； 黄淑帧；

【机构】 上海交通大学医学遗传研究所； 上海交通大学医学院医学科学研究院；

【摘要】 各种遗传性/先天性疾病的治疗一直是困扰医学生物学家的难题,特别是许多遗传性疾病常常会在出生前就给胎儿造成损害,因此及早治疗相当重要。干细胞宫内治疗能在怀孕早期机体免疫系统处于幼稚期阶段,将外源干细胞移植入胎儿体内,使干细胞能在受体体内归巢并增殖分化,从而达到治疗疾病的目的,不仅使患有遗传病的胎儿的主要器官在受损前受到保护,而且治疗作用可持续到出生以后,从而为一些难治疾病的治疗提供了一种有希望的途径。为了使干细胞宫内移植能应用到临床实践,首先需在动物体内进行宫内治疗的实验研究,通过建立干细胞嵌合体动物模型米探讨干细胞在体内的各种生物学特征和功能,为宫内治疗的实施奠定理论和技术基础。我们在成功地建立宫内干细胞异种移植山羊嵌合体的基础上,开展了同种异体嵌合小鼠模型的研究。由于小鼠是多胎妊娠,胎儿体积细小,且整个妊娠周期才21天,因此给干细胞宫内移植带来交大的技术困难。本文通过干细胞宫内移植方法的改进和移植条件的优化,终于建立了高移植成功率和嵌合率的同种异体嵌合小鼠模型。我们首先对宫内移植的工具进行改造。1)采用了目前国际上最小的注射针头,尽量减少注射时对胎鼠的损伤;2)将注射针头与头皮针连接,注射时通过与头皮针另一端连接的移液器来标化注射的细胞数量;3)手术时两人配合,一人负责注射胎鼠,另一人通过移液器控制注射量, 使手术时间大大缩短至10分钟内完成。其次,我们对宫内移植的方法进行了改进,选择了合适的麻醉剂利注射剂量,规范了手术操作流程以及移植手术后的护理。在上述工作的基础上, 将整合有绿色荧光蛋白基因(GFP)的转基因小鼠骨髓造血干细胞(HSCs)为供体,在孕鼠怀孕13.5天的时候进行宫内移植,在受体鼠出生后,应用巢式 PCR、流式细胞仪(FACS)、荧光显微镜和荧光原位杂交(FISH)等方法检测外源细胞在受体鼠体内的嵌合情况,并观察宫内移植方法改进对孕鼠产仔率和外源细胞嵌合率的影响。结果表明,宫内移植方法改进后. 减少了对胎鼠的损伤。缩短了宫内移植手术的时间。与方法改进前相比,孕鼠的产仔率(60 %vs.34%)利嵌合率(53%vs.29%)都显著提高(P<0.05)。尤其是运用改进后的移植方法首次将孕鼠宫内移植的时间提前到了孕12.5天,虽然孕鼠的产仔率与孕13.5天和14.5 天时进行宫内移植比较没有显著差异(P>0.05),但是能够取得较高的外源细胞的嵌合率(73 %),显著高于孕14.5天时移植的嵌合率(53%)(P<0.05)。通过宫内移植方法的改进, 明显提高了建立嵌合小鼠模型的效率,并应用干细胞宫内移植技术成功地修复和治疗了四氯化碳肝损伤小鼠和转 HSVtk 肝损伤小鼠,为研究产前治疗和干细胞体内的生物学行为等提供了有效的动物模型和科学手段。更多还原