曼地亚红豆杉MEP途径上MECT基因的克隆和分析

【作者】 王伟； 任肃霞； 刘万宏； 张婷婷； 陈敏； 廖志华；

【机构】 西南大学生命科学学院三峡库区生态环境教育部重点实验室； 重庆科技学院生物系； 西南大学药学院三峡库区生态环境教育部重点实验室；

【摘要】 紫杉醇作为20世纪后期发现的最有效的抗癌药物之一,对许多肿瘤,尤其是对肺癌、晚期卵巢癌和乳腺癌以及与爱滋病相关的 Kaposi’s sarcoma 的治疗有明显的疗效,在今后较长的一段时间内,紫杉醇将仍然是治疗癌症的首选天然药物。由于红豆杉生长缓慢且紫杉醇含量非常低,同时天然资源稀少,濒临灭绝,国家采取保护措施禁止砍伐,所以完全不能满足患者的需求。开展红豆杉的基因工程为解决药源缺乏的问题提供了崭新的思路,而开展紫杉醇生物合成途径的分子生物学研究是实现紫杉醇基因工程的首要工作。紫杉醇的生物合成起源于新近发现的 MEP 途径。为研究紫杉醇前体生物合成途径的分子生物学。本文采用 RACE 方法从曼地亚红豆杉中首次克隆了 MEP 途径上的关键酶基因 MECT(2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶)的全长 cDNA,并且对该基因进行了生物信息学分析、组织表达谱分析和功能验证。2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyltransferase,MECT)是紫杉醇前体生物合成 MEP 途径上的第三个酶。本试验采用 cDNA 末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法,第一次从曼地亚红豆杉中获得了 MECT 基因(TmMECT)。TmMECT 基因(GenBank 登录号:EF534010)全长1301bp, 包括5’和3’非翻译区、polyA 尾巴和一个编码939bp 的开放阅读框(open reading frame, ORF),它编码一条312个氨基酸残基的 MECT 蛋白质,其分子量为34.33kDa,等电点为8.22。 TargetP 分析结果显示 TmMECT 定位于质体,这个分析结果和植物 MEP 途径上的基因定位于质体这一事实相符。N 端含有长为83个氨基酸残基的转运肽,预测切割位点在 Arg83-Glu84之间。按照 Blast、Clustal W/X 和 GenBank 数据库多重比对和筛选分析氨基酸序列的同源性的结果分析表明,TmMECT 分别与银杏(Ginkgo biloba)的 MBCT、和拟南芥(Arabidopsis thaliana) 的 MECT 具有较高的同源性,一致性分别为59.3%、56.9%,相似性分别为69.1%、65.5%。序列对比主要差异来自 MECT 氨基酸 N-端序列,在植物中 MECT 的 N-端有引导 MECT 定位于质体的特有的转运肽,该转运肽在细菌中是没有的。通过 SOMPA 预测 TmMECT 的二级结构,结果显示 TmMECT 含有31.73%的α-螺旋,21.47%的延伸链,7.37%的β-转角和39.42%的无规则卷曲。纽织差异表达研究显示,TmMECT 在红豆杉根、叶、树皮、茎中均有组成型表达,在叶和树皮中表达较多。颜色互补试验表明 TmMECT 可以加速β-胡萝卜素的积累。对 TmMECT 基因的克隆分析和功能鉴定研究,有助于在分子遗传学水平上了解 TmMECT 的功能,并对研究紫杉醇前体合成的分子机理有一定帮助。更多还原