基于基因工程的小麦新型雄性不育产生的技术体系

【作者】 李林； 邓光兵； 龙海； 潘志芬； 余懋群； 易玲； 刘琳； 彭正松；

【机构】 中国科学院成都生物研究所； 西华师范大学生命科学学院； 四川农业大学；

【摘要】 小麦是世界上最主要的粮食作物之一,应用生物技术对小麦进行品种改良是国内外学者研究的热点之一。成熟胚取材方便,不受季节限制,再生能力较高,是小麦转化的重要外质体。本实验室构建了包含抗草甘膦除草剂 CP4基因和花药绒毡层特异表达启动子 tsp1,及针对其在雄性生殖细胞专一表达的阻遏蛋白基因 TetR 的戏元表达载体 PJH401。利用该表达载体在花药中特异表达蛋白 TetR,抑制了 CaMV35S 启动下抗草甘膦除草剂基因 CP4的表达,使得花药对除草剂敏感:而其他组织和器官中,TetR 基因不表达,抗除草剂基因 CP4正常表达, 使得其它组织和器官产生对除草剂的抗性。本研究试图利用农杆菌导入法介导将该双元表达载体导入小麦品种中,获得新型的雄性不育材料,建立获得雄性不育系的全新技术体系。本实验采用的基本培养基为 Ms 大量+Ms 微量+Ms 有机+VBI(5.00 mg/l)+肌醇(250.00 mg/l)+水解酪蛋白(1000mg/l)+脯氨酸(1000mg/l)+CuSO4(1.25mg/l)+蔗糖30g/l+琼脂8g/l。供试材料为小麦品种 yw243、CD-1437、1482和中国春的成熟胚作外植体诱导愈伤。诱导培养基为基本培养基+2,4 D(3.00 mg/l～5.00mg/1),继代培养基为基本培养基+2,4D(2.00 mg/l), 继代2次,每代2周。在浓度为5.00mg/1的2,4 D 下,yw243、CD-1437、1482和中国春四个品种的出愈率分别为90.3%、72%、85.2%和75.4%。而在3.00mg/l 的浓度下,yw243、CD-1437、 1482和中国春四个品种的出愈率分别为89.5%、72%、83%和74.5%。两种浓度的2,4D 作用下, 各小麦品种成熟胚的愈伤诱导率变化不大,但前者所得愈伤体积更膨大,质地较为疏松。愈伤组织继代2次后转入预培养基2～3天,(预培养基:基本培养基+2.00 mg/l 2,4D+甘露醇40.00 mg/l),浸菌30分钟,滤纸吸干转入共培养培养基(基本培养基+2,4D 2.00 mg/l+AS100.00um/l)中共培养三天,脱菌后在筛选培养基中筛选2代(基本培养基+2,4 D 2.00 mg/l+奇霉素70.00mg/l+Tim250.00 mg/l+0.4%农大)。后再转入分化培养基(基本培养基+KT1～2.00 mg/l+IAA0.20 mg/l+Tim250.00mg/1+0.4%农大/6BA2.00 mg/l+NAA0.20 mg/l+Tim250.00 mg/l+0.4%农大)中光照培养。2周后 yw243开始出现绿点,4周后有芽的分化。当苗长至3cm 左右将苗转入生根培养基(基本培养基+KT1.00 mg/l+NAA0.4 mg/l +Tim250.00 mg/l+0.4%农大)中培养生根。目前已在4个基因型转化材料中共获得10株,转化频率0.1%～0.3%。以这10株转化苗的基因组 DNA 为模板,对 CP4EPSPs、TetR、CaMV35S 和 tsp1等4个基因进行 PCR 扩增,发现 yw243中有3株能扩增出目标序列。是否这些材料为遗传稳定、整合和正确表达目标基因的转基因材料还需进一步研究。更多还原