L-MLCK作为死亡底物介导细胞凋亡及其机制研究

【作者】 张文程； 朱敏生；

【机构】 南京大学模式动物研究所；

【摘要】 <正>MLCK(myosin light chain kinase)是对肌球蛋白Ⅱ的轻链进行磷酸化的一种底物专一性磷酸化酶,它与肌肉收缩、细胞运动、损伤修复、细胞凋亡等过程相关。在脊椎动物中,MLCK主要有两种:横纹肌MLCK和平滑肌MLCK,平滑肌MLCK又有两个大小不同的异构体:210kD的L-MLCK 和130kD的S-MLCK,两者来自于同一基因的不同产物,L-MLCK的N端比S-MLCK多2个肌动蛋白结合位点和6个Ig样结构,我们的研究对象就是L-MLCK的N端4Ig结构。我们研究初步发现,当将L-MLCK的N端4Ig区导入细胞后,可直接诱导平滑肌和内皮细胞凋亡。由此我们提出假说,L-MLCK可能作为一种新的“死亡底物”参与细胞凋亡。我们首先证实了在Hela和鸡成纤维细胞中,当用VP16等药物刺激下发生凋亡时,L-MLCK是可以发生降解的,VP16的浓度达到25ug／ml时,western检测到一段大约100kD的降解片段,随着 VP16浓度的增加,残余的L-MLCK的量逐渐减少,因此这种降解有一定的剂量依赖关系,具体的酶切位点还需进一步确定。为了证实4Ig能够诱导细胞凋亡,我们构建了EGFP标记的4Ig真核表达质粒,将其转染到colon26等细胞中,发现细胞死亡增加,并且4Ig蛋白能聚集在细胞的特定部位, 形成绿色斑点,在9h大约有16．7％的转染细胞中出现斑点,到48h,这一比例上升到54．9％,以上结果提示我们,在一定的外物刺激下,L-MLCK会发生降解,4Ig可能会通过与某一特定蛋白或者细胞器结合来启动细胞凋亡,我们将用酵母双杂交来找到其结合的蛋白。由于质粒的转染效率较低, 我们已经构建好了4Ig的腺病毒表达系统,来具体研究4Ig诱导凋亡的生物学特征。更多还原