重组人内皮抑制素单体和二聚体的分离及其生物学活性探讨

【作者】 魏冬梅； 朱敏生；

【机构】 南京师范大学； 南京大学模式动物研究所；

【摘要】 <正>血管内皮抑素(endostatin)能够专一性地抑制血管内皮细胞,并由此而抑制肿瘤血管的形成。 Endostatin抑制内皮细胞的作用机制目前还不明确。很多研究表明,Endostatin,尤其是重组endostatin 的生物学活性不稳定,这一直是endostatin研究领域的困惑。我们曾观察到重组endostatin极易形成多聚体,且含有多聚体的endostatin其活性要高于只含有单体的。为此,我们分离了endostatin的单体和多聚体,以期为进一步研究endostatin的生物学活性及作用机制提供线索。本研究中,我们将重组人内皮抑制素(recombinant human endostatin)进行了原核表达、纯化, 并利用反向高效液相色谱(RP-HPLC)对其单体和多聚体进行分离,分别对其生物学活性进行了探讨。利用原核表达载体pET-28a在大肠杆菌BL21中诱导表达重组人内皮抑制素(rhEndostatin)。经IPTG诱导后,rhEndostatin在大肠杆菌BL21中高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在, SDS-PAGE结果显示表达产物的相对分子量为20kD,与预期的大小一致;包涵体经洗涤、溶解、复性后,用DEAE阴离子交换柱进行纯化,所得产物经SDS-PAGE检验,获得了纯度较高的rhEndostatin 的单体和多聚体的混合物;利用反向高效液相色谱(RP-HPLC)对此混合物进行分离,根据保留时间收集相应的峰形,所得收集峰经SDS-PAGE和Western blotting检测后表明:实现了rhEndostatin 单体和多聚体的分离;分离所得的单体和多聚体分别用体内鸡胚尿囊膜(CAM)新生血管实验检测生物学活性,结果二者均可使CAM新生血管化率下降,在40ug／ml量时单体和多聚体的抑制率为 31％和38％,而在80ug／ml量时单体的抑制率仍为30％,而多聚体的抑制率达到了58％,多聚体表现了比单体更明显的剂量依赖性。我们的研究证实,endostacin的多聚体具有生物学活性,同时也提示: (1)多聚体具有相同或更强的生物学活性,在药物制品中多聚体不会影响药物效果; (2)已经有研究推测,endostatin与内皮细胞的作用是非受体作用,endostatin通过某种方式与integrin家族中的α5β1发生作用,再通过 endostatin的肝素结合位点与位于内皮细胞表面脂伐的硫酸类肝素蛋白多糖发生作用,再通过脂伐的作用启动整个信号传导通道。我们的研究也支持了这一机制假说。更多还原