猪圆环病毒2型环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

【作者】 何逸民； 邹国秋； 罗玉均； 何冉娅； 秦宏阳； 孔留五； 张桂红；

【机构】 华南农业大学兽医学院；

【摘要】 引言:猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征(post -weaning multisystemic wasting syndrome,PNDNS)的主要病原,给养猪生产造成了重大的经济损失。由于PCV2的普遍存在,在基因诊断方面采用的PCR和Real-time PCR比较繁琐,给临床上的快速诊断带来不便。因此,发展一种简便、高特异且灵敏的核酸检测方法对PCV2的预防和控制工作显得尤为重要。材料方法:根据Genebank上公布的PCV2核酸序列,设计一套针对PCV2 cap基因的LAMP检测引物,优化LAMP的反应体系和反应条件,通过Real-time PCR制定标准曲线测试LAMP方法的敏感性,用优化好的LAMP检测各种已知病毒的核酸测试其特异性,然后进行临床样品的检测。结果与讨论:本研究对LAMP反应体系和反应条件的优化,结果表明PCV2 LAMP在63℃1h内能够成功的检测猪圆环病毒2型基因;敏感性和特异性试验表明本研究能够特异的检测PCV2并且其敏感度可以达到10个拷贝的DNA分子,通过临床样品的检测初步证明LAMP的阳性检出率与PCR的阳性检出率比较结果为100%符合。以上结果证明,LAMP扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在猪圆环病毒2型的快速检测方面具有一定的开发潜力。LAMP检测技术基本克服了目前在PCV2基因诊断方面存在的一些弊端。首先,该技术扩增反应在等温条件下进行,没有核酸的变复性过程,不但节省了大量的时间又减少了DNA酶和扩增核酸的污染机会,更重要的是,扩增反应只有在引物完全与识别的靶序列结合区匹配的情况下才能顺利进行,所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景,从而使检测特异性得到改善。加之LAMP法技术操作简便,且在等温条件下进行扩增靶序列,不需要复杂的仪器设备。其成本低,为临床检测提供了一个快速简便的新方法,十分适合于临床应用和疫情普查。更多还原