精原细胞增殖的激素和营养调控及其机理的研究

【作者】 王凯明； 张大雷； 米玉玲； 布同良； 曾卫东； 张才乔；

【机构】 浙江大学动物科学学院；

【摘要】 哺乳动物的生殖细胞发育是非常复杂的过程,受到多种激素、生长因子以及外源营养物质的调控。本试验以体外培养的小鼠A型精原细胞为模型,研究表皮生长因子（EGF）、前列腺素E₁（PGE₁）及多不饱和脂肪酸（PUFA）对A型精原细胞体外增殖的作用并探讨其机理,为哺乳动物生精细胞发育的激素和营养调控提供理论依据。出生6天的ICR小鼠的睾丸组织用胶原酶分散成单个细胞,建立精原细胞-体细胞体外无血清共培养系统。c-kit免疫细胞化学鉴定表明所分离和培养的生殖细胞为A型精原细胞。增殖细胞核抗原免疫组织化学检测表明添加了10μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白和3×10^-8 mol/L亚硒酸钠的DMEM培养液（ITS培养液）可维持A型精原细胞的存活和增殖。该系统经油红0及3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）染色鉴定,发现Sertoli细胞经油红0染色后呈阳性,而3β-HSD染色阳性的Leydig细胞在体系中极少,说明本试验所建立的培养系统系由A型精原细胞和Sertoli细胞组成。本试验利用该培养模型,探讨了PGE₁、EGF以及几种PUFA对小鼠A型精原细胞增殖及活性的影响。结果表明EGF和PGE₁均可促进精原细胞集落的形成,且PG受体拮抗剂SC19220可抑制PGE₁对精原细胞的促增殖作用,前列腺素环氧化酶-1（COX-1）特异性抑制剂SC560和环氧化酶-2（COX-2）特异性抑制剂NS398能显著抑制EGF促进精原细胞增殖的作用,揭示EGF可通过促进局部PG的产生而刺激精原细胞的增殖。并且,花生四烯酸（AA）与亚油酸（LA,n-6系列PUFA）在一定浓度范围内对精原细胞有明显的促增殖作用,其机理可能是通过促进PG的前体供给,对PG的产生有了一定的促进作用,而更高浓度的AA与LA则抑制精原细胞的增殖。亚麻酸（ALA,n-3系列PUFA）对精原细胞无明显促增殖作用。四甲偶氮唑蓝比色（MTT）法测定细胞活性发现,适当浓度的AA、LA以及ALA能够提高细胞活性,但当从达10^-4mol/L时,细胞活性下降。PKA、PKC免疫细胞化学染色结果发现,PUFA主要通过PKC信号途径增强细胞的活性。此外,AA及ALA能够增加LN和细胞间Cx43的表达,提示AA及ALA通过PKC信号通路增强了细胞活性,并通过促进LN和细胞间Cx43的合成调控细胞功能。更多还原