柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因sag10在Pichia pastoris中的表达及鉴定

【作者】 韩德强； 丁宏标； 乔宇； 索勋； 郝永清；

【机构】 中国农业科学院饲料研究所； 中国农业大学动物医学院； 内蒙古农业大学动物科学与医学学院；

【摘要】 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tozella)主要寄生在宿主鸡的盲肠,引起出血性盲肠炎,在鸡的7种球虫中,其致病力最强,严重影响养鸡业健康发展。该虫种生活史复杂,与其他虫种间几乎无交叉反应。目前使用抗球虫药是防治肉仔鸡球虫病的主要手段,但抗药性和药物残留等问题限制了球虫药物的广泛应用。分子生物学技术的迅猛发展为寄生虫疫苗的研发开辟了新的思路。从1987年Fites等克隆第一个鸡球虫抗原基因开始,对球虫基因亚单位疫苗研究日益受到关注。抗原的免疫原性决定着疫苗保护作用的强弱,对保护性抗原进行分离和鉴定是免疫预防研究工作的重点。球虫侵入宿主细胞的过程中,其子孢子和裂殖子表面蛋白在识别宿主细胞和介导黏附等过程中发挥关键作用。目前已经发现许多具有免疫潜能的球虫表面抗原,有些基因巳被克隆和表达,有些经免疫检测效果显著,其中表面抗原基因家族(sag基因家族)被认为是倒备基因工程疫苗重要的候选基因。毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。它具有完整的蛋白表达、加工和修饰功能,而且可以分泌表达外源蛋白。本研究通过在毕赤酵母中表达Eimeria tenella 表面抗原基因sag10,来探讨表达后的sag10生物学活性。提取柔嫩艾芙耳球虫北京株第二代裂殖子总RNA, 根据Oenbank报道序列(AJ586552)设计引物,应用RT-PCR技术扩增得到鸡球虫表面抗原sag10基因。将 sag10与真核表达载体pPIC9K连接,构建了pDQ052分泌型真核表达质粒,转化毕赤酵母GS115,利用0418 抗性筛选多拷贝重组菌株,进行优化表达。SDS-PAOE和Western blot检测表达结果,在43 kd处有明显的免疫印迹条带,表明目的蛋白得到表达,而且能被特异性抗体所识别,说明本研究通过外源重组技术实现了 Eimeria tenella表面抗原基因sag10在Pichia pastoris中的表达,表达的SAG10蛋白具有生物学活性,为下一步进行免疫保护研究提供了材料。更多还原