镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的克隆、表达和抗蜱免疫保护作用

【作者】 陈灵芝； 周金林； 周勇志； 龚海燕； 李培英； 沈杰；

【机构】 中国农科院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室； 安徽农业大学畜牧水产学院；

【摘要】 根据半胱氨酸蛋白酶的活性位点保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子使用偏好设计引物,PCR 扩增、测序并分析得到两个镰形扇头蜱的半胱氨酸蛋白酶基因片断,再通过5’RACE 的方法得到全长基因序列。RhcA 全长1168bp,开放阅读框从第58个碱基到第1053个碱基,编码332个氨基酸序列,预测分子量为36KDa。RhcB 全长1153bp,开放阅读框从第43个碱基到第1047个碱基,编码335个氨基酸,预测分子量约为37KDa。同源性分析表明,这两个序列均含有半胱氨酸蛋白酶活性位点C²⁵、HI¹⁵⁰ 和N¹⁷⁵ 处的保守性氨基酸序列,且与其它物种的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶有很高的同源性,其中,RhcA 与其他蜱种或物种的半胱氨酸蛋白酶在氨基酸水平上的同源性为58.5%～79.8%;RhcB 与其他蜱种或物种的半胱氨酸蛋白酶在氨基酸水平上的同源性为56.7‰89.8%。因此,将RhcA 和RhcB 命名为镰形扇头蜱两个新的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶基因。RT-PCR 分析表明,RhcA 和RhcB 在镰形扇头蜱的不同发育阶段表达情况不一。将RhcA 和RhcB 基因亚克隆到表达质粒pET32a（+）中,构建重组质粒pET32a/RhcA和pET32a/RhcB,转化到BL21（DE3）表达菌后,经IPTG 诱导表达。SDS-PAGE表明,重组质粒pET32a/RhcA 和pET32a/RhcB 均得到高效表达。Westem Blot 显示二个重组蛋白均可被蜱抗唾液抗体识别。二个重组蛋白纯化后,按常规免疫程序免疫实验兔,并进行成蜱感染实验。结果表明,与对照组相比,免疫组兔子对镰形扇头蜱侵袭和吸血显示出明显的保护作用。对照Trx 免疫组,接种蜱48小时后,吸附率为68%,而RhcA 和RhcB 免疫组仅为17%和16%。对照组蜱的饱血率为54%,而RhcA 和RhcB 免疫组仅为42%和22%。本文报道的镰形扇头蜱两个组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶新基因序列已登录GenBank,cysA 和cysB 的基因序列号分别为AY336797和AY336798。更多还原