日本脑炎病毒SA14-14-2株E基因抗原域Ⅲ的克隆及高效表达

【作者】 郑其升； 杨松； 徐学清； 张晓勇； 曹瑞兵； 陈德胜； 陈溥言；

【机构】 南京农业大学农业部畜禽疫病诊断与免疫重点实验室；

【摘要】 根据GenBank公布的Japanese Encephalitis Virus(JEV)SA14-14-2减毒株的核苷酸序列(GenBank登录号:AF315119),设计并合成一对特异性引物。应用RT-PCR方法扩增出编码JEV囊膜蛋白抗原域Ⅲ的基因(EⅢ),将其克隆入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达载体pET-EⅢ。阳性质粒转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,JEV-EⅢ基因获得表达,经细胞定位分析,目的蛋白以包含体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达EⅢ蛋白的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.1mmol L-1,诱导时间为3 h,在大肠杆菌中的最高表达量为54.9%。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。利用纯化的表达产物作抗原包被酶标板,可以明显的区分JEV阴阳性血清,并且不与PRV、CSFV、PRRSV、PPV、PCV的阳性血清发生反应,结论:重组JEV EⅢ蛋白可以用于检测猪血清中JEV抗体水平。更多还原