巢式PCR检测隐孢子虫卵囊的研究

【作者】 张龙现； 蒋金书； 刘群； 宁长申； 朱引洁； 吴绍强；

【机构】 河南农业大学； 中国农业大学动物医学院；

【摘要】 隐孢子虫病是一种重要的人畜共患原虫病。为了在临床样品中更准确、快速地检测隐孢子虫卵囊,从初步纯化的含有不同数量隐施子虫卵囊的样品中和含有不同数量隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中,直接提取DNA或用DNA纯化试剂盒对提取的奶牛粪便中卵囊DNA进行纯化之后用作起始PCR（Primary-PCR）模板,以起始PCR的产物为模板进行巢式PCR（Nested-PCR）,用2对人工合成寡核苷酸分别作为两个PCR的引物,扩增片段大小分别为1325bp和820bp。优化了Mg²⁺ 浓度、引物浓度和dNTP浓度,并进行了特异性检验。建立的巢式PCR具有隐孢子虫属特异性,不仅扩增出新鲜样品DNA提取物中的目的片段,而且扩增出放置6年之久的DNA提取物中的目的片段。样品经过初步纯化之后,起始PCR和巢式PCR最低检测值分别为2.86×10³个印囊/ml和≤2.86个卵囊/ml;从含有隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中提取DNA,尔后经过DNA纯化试剂盒纯化,其起始PCR和巢式PCR最低检测值分别为2.86×10⁷个卵囊/g粪便和≤28.6个卵囊/g粪便。有望发展为试剂盒。更多还原