肌腱细胞生物衍生肌腱复合物动态培养条件初探

【作者】 梁凯路； 秦廷武； 杨志明； 李秀群； 王珍；

【机构】 四川大学华西医院人类疾病生物治疗教育部重点实验室·干细胞与组织工程研究室；

【摘要】 目的在肌腱细胞衍生物生肌腱复合物的三维培养过程中引入周期性牵张应力,将有助于在体外构建更为成熟的组织工程化肌腱。问题的关键在于加载条件的界定。加载条件因细胞,细胞支架,加载方法不同而异。本课题以肌腱细胞,人衍生肌腱,牵张应力细胞培养系统为基础,初步探讨合适的加载频率,牵张幅度,以及每小时加载时间。方法①肌腱细胞为取初生罗曼鸡屈肌腱,用0.25%胰蛋白酶。0.1%1型胶原酶消化下细胞。将细胞传代扩增致2-4代;②将人衍生肌腱制成长20×3×2mm的扁圆形细胞支架;③将细胞接种到细胞支架上,3×105/支架。分成静态组和加载组,每组3个支架。静态组用含10%小牛血清的F12于37℃,5%CO2孵箱中培养96小时,加载组先在相同条件下培养48小时,再加载培养48小时;④培养结束后将细胞从支架上消化下来并用细胞记数板记数。0.05作为加载频率。通过统计学方法比较支架上的细胞数选出最佳频率F。每小时作用时间为15min,加载频率F不变,分别以5%、10%作为牵张幅度,选出最佳牵张幅度S。频率F,牵张幅度S不变,分别以15min、10 min和25 min作为每小时加载时间,选出最佳每小时加载时间T。将频率F,牵张幅度S,每小时加载时间T作为加载条件,作用于细胞-支架复合物。所得复合物作扫描电镜观察,观察细胞在支架表面的排列。作组织学切片,观察细胞在支架内部的生长情况。将频率F,牵张幅度S,每小时加载时间T作为加载条件,作用于细胞-支架复合物,分成静态组和加载组,每组3个样本,比较细胞对羟脯氨酸的合成量。结果加载条件为0.05Hz,牵张幅度5%,每小时加载时间15min,肌腱细胞的增殖最为明显;扫描电镜观察,加载组细胞在支架表面的排列较静态组更趋有序;组织学切片示,在加载组,较多的肌腱细胞长入支架内部。加载组肌腱细胞对羟脯氨酸的合成量明显高于静态组(P<0.05)。结论当牵张应力细胞培养系统以加载条件为0.05Hz,牵张幅度5%,每小时加载时间15min作用于肌腱细胞人衍生肌腱复合物48h后,牵张应力明显促进肌腱细胞增殖,促进细胞对功能蛋白的合成,促进细胞在支架表面的有序排列,以及促进细胞在支架内部的生长。更多还原