变性高压液相色谱技术在结核分枝杆菌对链霉素的耐受性检测中的应用

【作者】 孙照刚； 张健源； 张旭霞； 李妍； 邱云青； 田苗； 聂理会； 任卫聪； 李传友；

【机构】 北京市结核病胸部肿瘤研究所；

【摘要】 目的利用变性高压液相色谱（DH- PLC）技术快速检测结核分枝杆菌 rpsL 基因的突变,从而对结核分枝杆菌是否耐受链霉素类药物做出初步判断。方法提取试验菌株基因组 DNA,扩增 rpsL 基因片段。分别与 H₃₇Rv 标准株的相应 PCR 产物混合、杂交后,利用 WAVE 核苷酸片段分析系统对各杂交产物进行 DHPLC 检测；序列测定结果与相应的 DHPLC 检测结果进行比较以验证 DHPLC 检测的准确性。体外药物敏感性试验,确定122株结核分枝杆菌临床分离株对链霉素的敏感性,通过比较药物敏感性和 DHPLC 检测结果,建立两者之间的对应关系。此外我们还检测了32株对链酶素敏感的临床分离株进行了 DHPLC 法检测,以明确该检测方法的特异性,我们还检测了另外32株。结果经体外实验证明结核分枝杆菌临床分离株对链毒素耐受性,rpsL 基因43位氨基酸突变通常会引起较高程度的链霉素耐受性。88位氨基酸突变菌株对链霉素的耐受性较低。链霉素耐受菌中发生 rpsL 基因突变的菌株约占78．7%（96/122）。其中以43位氨基酸突变为主（75．4%）。利用 DH- PLC 技术检测 rpsL 基因突变,虽然不能检出缺失突变形式,但与直接测序法相比检出率为 98．9%（95/96）。对所有耐受链霉素的结核分枝杆菌临床分离株而言,利用 DHPLC 技术可以达到77．9%（95/1 22）的耐药菌检出率,与序列测定法的检出率相近（96/122）。并且根据 DHPLC 检测图谱能够很好的判断 rpsL 基因的碱基突变形式。结论 DHPLC 法是快速检测出结核分枝杆菌 rpsL 基因碱基突变的好方法。对链霉素耐受菌而言,碱基突变与结核分枝杆菌耐受链霉素类抗生素存在高度的相关关系,因此 DHPLC 技术用于临床早期检测结核病人是否对链霉素具有耐药性具有良好的应用前景。更多还原